透化细胞和退化细胞器中蛋白质的磷酸化实验
试剂的制备
单层培养细胞的透化
悬浮培养细胞的透化
用分离的亚细胞组分分析蛋白质的磷酸化
用分离的亚细胞组分进行激酶分析
试剂、试剂盒 | 胞外缓冲液 胞内缓冲液 透化缓冲液 标准裂解缓冲液 裂解缓冲液 SDS-PAGE 加样缓冲液 双向-PAGE 裂解緩冲液 |
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实验步骤 | 这些试剂在后面许多地方要用到,应在进行下述实验前配好。 1. 胞外缓冲液(pH 7.2,37℃) 110 mmol/L NaCl 10 mmol/L KCI 1 mmol/L MgCl2 1.5 mmol/L CaCl2 30 mmol/L HEPES 10 mmol/L 葡萄糖 过滤灭菌,4℃ 保存可达 1 个月。 2. 胞内缓冲液(pH7.4,37℃) 25 mmol/L NaHCO3 120 mmol/L KCl 1 mmol/L KH2PO4 10 mmol/L MgCl2 20 mmol/L HEPES 10 mmol/L 葡萄糖 过滤灭菌,4℃ 保存可达 1 个月。 3. 透化缓冲液(pH7.4,37℃ ) 120 mmoI/L KCl 25 mmol/L NaHCO3 5 mmol/L HEPES 10 mmol/L MgCl2 1 mmol/L KH2PO4 1 mmol/L EDTA 30 μmol/L CaCl2 该缓冲液含有 100 nmol/L 游离钙离了。过滤灭菌,4℃ 保存几个月。 4. 标准裂解缓冲液(pH 7.4,37℃) 50 mmol/L HEPES 100 mmol/L NaCl 2 mmoI/L EDTA 2 mmol/L EGTA 50 mmol/L NaF 10 mmol/L β-磷酸甘油 1 mmol/L Na3VO4 1% NP-40 或 Triton X-100 4℃ 保存可达 6 个月。 5. 2X 裂解缓冲液(pH 7.4,4℃) 100 mmol/L HEPES 200 mmol/L NaCl 40 mmol/L EDTA 4 mmol/L EGTA 100 mmol/L NaF 20 mmol/L β-磷酸甘油 2 mmol/L Na3VO4 2% NP-40 或 Triton X-100 为了螯合激酶反应中过剩的镁,该缓冲液含 10X EDTA。4℃ 保存可达 6 个月。 6. 2X SDS-PAGE 加样缓冲液 0.125 mol/L Tris-HCl ( pH 6.8) 室温 4ml 10% SDS (w/v) 4ml 甘油 1ml β-巯基乙醇 0.4ml 水 0.6ml 溴酚蓝 20mg 7. 双向-PAGE 裂解緩冲液 20 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0) 0.3% SDS (w/v) 1% β-巯基乙醇(v/v) 8. 双向-PAGE 加样缓冲液 尿素 6g NP-40 4ml 40% 在所需 pH 范围内的两性电解质 0.5ml DIT 0.154g 水 1.12ml 分成小等份 -70℃ 保存可达 1 个月。 |
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