聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳
实验概要
本实验介绍了血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的原理、试剂配制、操作步骤及注意事项等。
实验原理
本实验利用聚烯酰胺凝胶作电泳支持物。电荷和分子大小不一的各种血清蛋白质通过浓缩效应、电荷效应、分子筛效应而被精细地分离。由于具有以上三种效应,所以此方法分离效果好,分辨率高。血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳仅能分成5~7个组份,而在聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳中可分出12~30个组份。
主要试剂
试剂
试剂号 | 名称 | 配制方法 | pH |
1 | 分离胶缓冲液 | 1N HCl 48.0ml Tris 36.3g 加蒸馏水到100ml | 8.9 |
2 | 单体交胶剂 | 丙烯酰胺30.0g 甲叉双丙烯酰胺0.8g 加蒸馏水到100ml | |
3 | 催化剂 | 10%过硫酸铵(临用前配制)100mg/ml | |
4 | 加速剂 | 四甲基乙二胺(TEMED)1ml加蒸馏水稀释到10ml | |
5 | 浓缩胶缓冲液 | 1N HCl 48.0ml Tris 5.98g加蒸馏水到100ml | 6.7 |
6 | 电极缓冲液 | 甘氨酸28.8gTris 6.0g加蒸馏水至100ml临用前按1∶10比例稀释 | 8.3 |
7 | 示踪染料溶液 | 溴酚兰0.05g加蒸馏水溶解至100ml | |
8 | 固定染色液 | 考马斯亮兰G25010mg 无水乙醇4.7ml 磷酸8.5ml 定容到100 ml |
凝胶溶液配制表
试 剂 | 分 离 胶 溶 液(ml) | 浓 缩 胶 溶 液(ml) |
1号 | 1.25 | —— |
2号 | 2.5 | 1 |
5号 | —— | 1.25 |
蒸馏水 | 6.05 | 7.35 |
3号 | 0.05 | 0.1 |
4号 | 0.15(1∶10稀释液) | 0.3(1∶10稀释液) |
总体积(ml) | 10 | 10 |
浓度(g%) | 7.7 | 3.0 |
附注:凝胶聚合速度受温度影响较大,温度低时,聚合速度减慢,需适当调整3号及4号试剂的用量,达到在30分钟左右聚合。
主要设备
1. 园盘电泳槽
2. 电泳仪
3. 玻管(10×15px)
4. 50μl微量注射器、5ml注射器
5. 250px长的局麻针头、18号针头
6. 长细滴管
7. 小浇杯
8. 橡皮管、吸耳球等
实验材料
血清蛋白
实验步骤
1. 凝胶柱的制备:
1) 取已准备好的10×15px的玻管,从一端量至175px处,用玻璃腊笔划线。起始端用胶布包封好后,插入橡皮塞中,垂直放好。
2) 分离胶的制备:
a. 按分离胶配制表的比例(附后),取1号、2号试剂和蒸馏水加入一小烧杯中,混合后,再加入3号和4号试剂,混匀后即成为分离胶溶液(此溶液约在半小时内聚合为聚丙烯酰胺凝胶,故应尽快操作。如室温较高时,为防止过快聚合,可放置冰浴中操作。或根据聚合速度的快慢,适当调整TEMED的加入量)。
b. 用5ml注射器、18号针头或用长细滴管吸取分离胶溶液,将其沿玻管管壁注入玻管,直至175px划线平面。
c. 用长细滴管吸取蒸馏水,沿管壁在分离胶的液面上加注12.5px高的水层。加水时必须缓慢细流,尽量减少胶液表面的震动与混合。(加注水层是为了使凝胶聚合后的表面平整而不致出现弯月形,并能使凝胶与空气隔绝。这一步很重要,它将直接影响分辨率与带形)。
d. 将加注好的凝胶管静置1小时,以进行聚合反应。在聚合过程中,起初凝胶与水层的界面逐渐消失,待胶体形成后,其界面又将重新可辨。这一现象可用来观察判断凝胶的聚合是否完成。
3) 浓缩胶的制备
a. 按浓缩胶配制表的比例取2号、5号试剂和蒸馏水加入另一小烧杯中,混合后,再加入3号和4号试剂,混匀后即成为浓缩胶溶液。(在制备浓缩胶时,也常用核黄素催化的光聚合来代替过硫酸铵催化的化学聚合作用)。
b. 用滴管和滤纸小心地吸去已聚合好的分离胶胶面上的水液。注意切勿触及胶面。
c. 用长细滴管或注射器吸取浓缩胶溶液,在分离胶胶面上沿玻管壁小地注入0.5~25px高的胶液。然后同样沿玻管壁缓慢细流地加入12.5px高的蒸馏水。静置一小时后即可使用。
在加样之前先用滴管或滤纸小心地吸去浓缩胶胶面上的水液。
2. 加样:
用50μl的微量注射器,取12μl血清,加12μl的40%蔗糖溶液(1∶1稀释),再加入40μl0.05%溴酚兰指示剂,混匀。每管中加入该混合液16μl,共可加4管。每管实际加入纯血清3μl,含蛋白质196μg。(血清蛋白质含量为6.2克/100毫升血清)
若需增减管数,亦照此加样比例推算。
3. 电泳
1) 将加样完毕的凝胶管上端垂直插入上电极槽底板的橡胶塞孔中。并去掉下端的橡皮塞和胶布。
2) 先用长细滴管吸取电极缓冲液,在已插好的凝胶管样品液面上,小心地逐管加满电极缓冲液。然后将电极缓冲液慢慢地倒入上、下电极槽中。注意避免和排除凝胶管的上、下管口内留有气泡,否则会影响导电。电极缓冲液的加入量,上槽以电极能完全浸入为宜,下槽以凝胶管浸入3/5为宜。
3) 将上槽的电极接电泳仪的负极,下槽的电极接电泳仪的正极。先调节电流为1mA/管,待示踪染料进入分离胶后,再调节电流为2~3mA/管。待示踪染料迁移至距管下口12.5px时,切断电源,电泳完毕。
4. 剥胶
取下凝胶管,用带250px长针头的注射器吸取蒸馏水作润滑针。将针头小心插入管壁与胶柱之间,一边注水,一边使针头紧贴管壁慢慢呈螺旋式前进。如果一头不行,再在另一头按同样的方法剥离,直至胶柱与管壁分开,从玻管中滑出。如胶柱不能滑出,可用洗耳球从一端加压吹出。
5. 固定、染色及漂洗:
将剥出的胶柱浸入8号试剂60℃水浴30-60分钟,进行染色,然后用清水冲洗掉多余的染料。
注意事项
1. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯胺是神经性毒剂,并对皮肤有刺激作用,注意避免直接接触。大量操作时应在通风橱中进行。
2. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中,置冰箱内(4℃)保存。可贮存1~2月。测定pH值(4.9~5.2)可检查其是否失效。失效液不能聚合。
3. TEMED要密封保存,过硫酸铵溶液最好当天配制,以防止氧化失效。
4. 凝胶的聚合速度与温度关系很大,必须根据实验时的温度调整3号、4号试剂的用量,以使凝胶在30分钟内聚合。