体内处理精原干细胞产生转基因小鼠的试验方法
实验概要
本试验描述了通过体内处理小鼠精原干细胞产生转基因小鼠的技术，其成功率高。在此次研究中通过的将幼鼠的精原干细胞（SSCS）与重组慢病毒表达的EGFP -F在体内感染，然后与正常雌性交配。转基因可遗传和前处理的小鼠可在多次交配试验中使用。这项技术可以适用于模拟接近人类发展和疾病的实验室动物模型。
实验原理
转基因小鼠的产生促使我们理解成长和发展的各个方面了有了巨大的进步。使用各种技术将一个单细胞胚胎植入到伪孕妈妈或用干细胞植入技术生成淘汰或基因敲除小鼠。这些实验昂贵，劳动密集，费时和需要好几个女的捐助者。精原干细胞是负责生产精子和合适的生殖转换对象。Nagano等将重组逆转录病毒体外感染精原干细胞，然后异种移植到雄性小鼠睾丸细胞后产生转基因小鼠产生。在某些情况下受体小鼠很难接受供体的精原细胞，其成功率是相当低的。同样，携带lacZ基因的逆转录病毒与睾丸生殖细胞的体内转导，其成功率为2.8％。植入后的低成功率阻碍了胚胎植入。但是使用慢病毒的实验，能提高其成功率。
主要试剂
慢病毒pLKO.1 EGFP-F12。病毒滴度可以从 105~106 TU/ml。
麻醉剂：使用50mg/ml盐酸氯胺酮和20mg/ml二甲苯胺噻嗪盐酸盐的混合物，并用生理盐水稀释至终浓度二甲苯胺噻嗪盐酸9g/L，盐酸氯胺酮1.6g/L。
其他化学品：Tris-HCl，台盼蓝染料，十二烷基硫酸钠（SDS），氯化钠（NaCl），EDTA，蛋白酶K，多聚甲醛，甘油，氨苄青霉素（钠盐）和卡那霉素，以上试剂均购于Sigma公司；dNTPs 购于Promega公司；Taq聚合酶购于New England Biolabs公司。
主要设备
动物麻醉系统（拉斯，型号901807，VetEquip公司）
光纤照明体视显微镜（尼康公司）
PCR仪分光光度计
UV-2450紫外可见分光光度计（岛津公司）
实验材料
试验动物：任何品系的小鼠都可以使用。公鼠最好选择一月龄。本实验选择28-32日龄小鼠（CRL：CFW），重约20-25克。
动物饲养：按标准配方和无菌水饲喂；环境温度保持在23±20。C；相对湿度：40-70％；光线：7:00至19:00有光线； 19:00至7:00暗室。
实验步骤
1. 制备高滴度pLKO.1 EGFP-F PURO慢病毒载体。
1)将产生的 LVs，溶解于DPBS溶液。慢病毒的生物效价决定于受感染的不同浓度病毒稀释的HEK-293细胞，病毒一般为105~106 TU/ml。
注意：
a. 病毒应分装保存在80℃，可以保存至少1年且病毒滴度无明显改变，在-80℃。如果病毒在一星期内使用，可以储存在4℃。
b. 慢病毒能够感染人体细胞。应穿戴手套和防护服装。避免泄漏和飞溅。慢病毒不稳定，容易被乙醇，清洁剂或漂白剂溶解。任何泄漏或工作完成后，用乙醇或漂白剂消毒工作区。
2. 体内传导所需的基因在睾丸
注意：所有的动物实验研究，应按相关的指导规则，在相应的权限和规定内执行。以下所有步骤应在无菌环境下进行。
1) 向日龄28雄性小鼠腹腔内注射三溴乙醇（Avertin）（Sigma公司）（2,2溴乙醇和T-戊醇，按体重0.015ml/gm），关键步骤防止麻醉过量，不当的麻醉剂量可使动物致死。
2) 从小鼠腹股沟区剃毛和消毒。无菌条件下选择阴茎前方，正中线皮肤切口，中央切口是首选的手术方法，一个切口取出两个睾丸。
3) 切开肌肉后，在弯夹钳的帮助下剥离与腹腔睾丸连着的脂肪层。
4) 使用30号针头的注射器刺破睾丸组织，向睾丸间的管状空间内插入含台盼蓝染料（0.04％）LV的30号针头。添加台盼蓝监测在刺入睾丸的准确性。
5) 向睾丸缓慢注入约10-20mL LV液。
注意：每次注射后，等待30秒后拔出注射器以防止LV回流。注入DNA液的总体积不宜超过20μL，大量注射的慢病毒可能会使睾丸破裂。
6) 将注射后的睾丸放回原位，由手术摘除对侧睾丸，缝合内部和外部的伤口。
注意：在手术中，不摘除连同睾丸的脂肪或任何其他组织。要用无菌尼龙线结扎血管，防止出血，小心不要弄破睾丸。
7) 在缝线的部位涂抹抗生素软膏（新霉素和多粘菌素B硫酸盐和杆菌肽锌粉，Glaxo Smith Kline，印度），保持小鼠于热板上约1h，麻醉中的动物容易苏醒。
3. 转基因株系的建立
注：在小鼠实验中，它需要30天左右完成一个精子的周期：从精原细胞到精子。
1) 注射后LV30天进行交配，注射的动物与2个月龄的野生型（WT）雌性动物交配，幼畜出生后通常在22-30天交配。
2) 从3周龄鼠取尾2-75px进行活组织检查， 将其培育在他们在高盐的消化缓冲（50 mM Tris HCl，1％SDS，100mM NaCl，100mM EDTA和1200μg/ml蛋白酶K）中，55oC，16h。
注意：将20mg蛋白酶K溶解于1mL无核酸酶水中。分装蛋白酶K，并保存在-20°C， 任何冻融可能会使蛋白酶K的失活。
3) 裂解分离DNA，酚氯仿萃取，乙醇沉淀。
注意：苯酚和氯仿对健康造成危害，戴上手套和保护眼睛。
4) 用紫外分光光度计检查A260nm处260nm / 280nm的比值定量DNA浓度的和纯度。
5) 稀释DNA浓度至200ng/μl和进行PCR。
4. 采用聚合酶链反应（PCR）筛选转基因小鼠
1) 准备一个最佳的反应混合物体中： 1X Taq酶缓冲液，0.2mM dNTPs，0.25µM上、下游引物， 0.06U的TaqDNA聚合酶和20ng质粒或200ngDNA基因组模板。混匀后短暂离心。Peltier Thermal Cycler PTC-200预热液体后开始链式反应。(MJ Research, Minnesota, USA).
2) 设置引物的PCR循环条件。根据1.5％-2％TAE琼脂糖凝胶分析PCR产物。
注意：每次PCR，野生型基因DNA和无DNA（模板）作为阴性对照，表达转基因的纯化质粒作为阳性对照。
3) 从F1代起，PCR阳性幼鼠应与野生型雌性交配产生下一代。通过近亲繁殖转基因后代产生纯代系。
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科技前沿
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项目成果
