非放射性地高辛标记DNA探针法
实验概要
掌握非放射性地高辛标记DNA探针法。
实验原理
以往人们是用放射性同位素来标记探针DNA。近年来，非同位素标记方法发展很快，已有取代同位素标记法的趋势。地高辛配基随机标记DNA探针法，是较为成功的一种非同位素标记方法（Saiki等，1985）。其原理是：用化学方法把类固醇类半抗原地高辛分子连接在dUTP上（Dig-dUTP）。用随机引物及DNA多聚酶，以探针DNA为模板，合成互补DNA，化学修饰过的dUTP同时掺入到标记的DNA探针中。杂交后用碱性磷酸酶标记的抗地高辛单抗与标记探针DNA中的Dig-dUTP结合，加入显色底物，在碱性磷酸酶作用下，转变成深棕色或蓝色的化合物。或用X-film放射自显影。 地高辛标记DNA的基本过程是：制备DNA探针，标记探针，检测样本。其中关键步骤是要得到高灵敏度、高特异性的探针。
标记：采用随机引物标记方法，可标记少至10ng，多至3ug的DNA。能在新合成的DNA链每20-25个核苷酸，掺入一个Dig-dUTP，反应时间约为1h。
杂交：按标准杂交方法进行。可以采用尼龙膜或硝酸纤维素膜。用过的杂交液可冻存于-20℃，重复使用。
免疫学检测：封阻后，检测反应的第一步，抗体结合物与标记DNA结合，出现杂交的半抗原-标记DNA，显色反应起始是在碱性pH条件下加入无色的显色剂X-磷酸盐和硝基兰四唑NBT，在几分钟内便开始出现蓝色，显色反应的过程持续3天。典型的例子是在24小时后终止显色反应。用二甲基甲酰胺洗掉尼龙膜上的颜色后，尼龙膜可重新用于杂交。
应用：地高辛配基标记DNA探针及检测试剂盒，能检测0.1pg的同源DNA，能检测1µg哺乳动物DAN中的单拷贝基因，与放射性标记系统比较，此试剂盒能快速得到实验结果（从DNA的标记和杂交至见到检测结果24h内能完成），而且消除了放射性的不安全问题。试剂的灵敏度与特异性使它适用于所有的杂交技术（包括DNA-印迹转移，菌落杂交，噬菌斑杂交及原位杂交）以替代同位素标记和放射自显影术。
主要试剂
1. DNA稀释缓冲液有两管，每管1ml：
[成分为：Tris-HCl(10mM)，EDTA(1mM)，pH8.0(20℃)]内含鲑鱼精DNA（50µg/ml）。
2. 六聚核苷酸混合物
3. 标记用混合底物：此管内有50µl，浓度的dNTP标记用混合底物，含dATP（1mL）dCTP(1mM)，dGTP(1mM)，dTTP(0.65mM)和Dig-
dUTP(0.35mM)，pH6.5(20℃)。
4. DNA聚合酶Ⅰ大片段（标记级）：此管内有25µl，DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow），2 U/µl 。
5. （Dig）AP结合物：此管内有200µl，多克隆羊抗地高辛配基Fab-片段，结合有碱性磷酸酶750 U/ml。
6. NBT有两管，每管1.25ml，溶于70%（V/V）二甲基甲酰胺的硝基蓝四唑盐溶液（75mg/ml）。
7. X-磷酸盐，两管，每管0.9ml，溶于二甲基甲酰胺的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐的甲苯胺溶液（50mg/ml）。
8. 封阻试剂，两瓶，每瓶有50g粉剂。
需配制的溶液：
EDTA(0.2M),pH8.0(20℃)
LiCl(4M)
70%(V/V)乙醇
Tris-HCl(10mM)
EDTA(1mM)，pH8.0(20℃)
10%(V/V)N-十二烷基肌氨酸钠盐
10%(V/V)SDS
0.3M柠檬酸三钠
3M NaCl
20×SSC
pH7.0,Tris-HCl(100mM)
NaCl(150mM)
pH7.5Tris–HCl(100mM)
MgCl2(50mM)pH9.5(20℃)
NaCl(100mM)
实验步骤
1. 取10µl待测DNA，于1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。
2. 凝胶用溴化乙锭染色，切掉凝胶四周多余部分，并在凝胶的一角作一记号, 拍照, 记录电泳结果(拍照时, 凝胶旁放一尺子)。
3. 杂交用胶的制备
(1) 将凝胶浸没入30mL 0.25M HCl溶液中15min，使DNA脱嘌呤。
(2) 用蒸馏水短暂洗凝胶2次。
(3) 将凝胶浸没入30mL 0.4M NaOH中30min, 使它被中和。
4. 准备DNA从凝胶向膜转移的平台
(1) 将1张待用尼龙膜和3张厚滤纸切成与待转移胶相同大小，并在尼龙膜一角做一标记。
(2) 另1张厚滤纸切成与凝胶相同宽度，长度(约450px)足以达到转移液盒子的底部。
(3) 准备10 X SSC 转移液。
(4) 将待用尼龙膜用蒸馏水浸湿后，再浸入10 X SSC 转移液中。
5. 安装毛细管转移装置
(1) 将长的滤纸放在转移平台的顶部，滤纸两端达到转移盒的底部，做成虹吸桥。
(2) 将8 0mL转移液倒入转移盒内，并湿润滤纸。
(3) 将凝胶背面朝上置于滤纸搭成的桥上，凝胶与滤纸间避免有气泡。
(4) 用保鲜纸封住凝胶四边。
(5) 将浸湿的转移膜置于凝胶的上部，凝胶与膜间避免有气泡。
(6) 将剩下的3张滤纸小心的放在转移膜的上面，并放一叠吸水纸搭在滤纸上，再放一玻璃板，其上压一重物。
(7) 转移几小时或过夜(至少4小时)
注意：勿使转移液干枯。
6. 已转移的DNA与膜交联
(1) 将膜放在浸有10 X SSC的厚滤纸上，有DNA的一面朝上。
(2) 将膜置于UV 交联器（crosslinker）中，在紫外光下自动交联3min。
(3) 用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜，空气中干燥。
此膜可在4℃长期保存。
7. 标记DNA探针 每次标准的反应可标记10ng至3ug线性的DNA，也可标记更大量的DNA，但所有的成分和体积要相应增加。
(1) DNA探针热变性，煮沸10min，迅速冷却于冰/乙醇中5min以上，待用。
(2) 取Eppendorf管（1.5ml）置于冰上,加下列及试剂：
新鲜变性的DNA 1-3µg
六聚核苷酸混合物 2µl
dNTP标记用混合底物 2µl
加无菌重蒸水至 19µl
DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow 5U/ul）1µl
(3) 在37℃保温至少60min，可到20h。
(4) 煮沸5min，终止反应。
(5) 15000rpm离心30s，置于冰上待用。
8. 预杂交 按2500px2膜用20-40ml预杂交溶液，预杂交时使溶液处于流动状态。
预杂交液组成：5×SSC
0.5%（W/V）封闭试剂：1%聚蔗糖（Ficool 400），1%PVP，1%BSA。
0.1%（W/V）N-十二烷酰肌氨酸钠
0.02%（W/V）SDS
膜放入塑料袋，灌入预杂交液，排除气体后密封，在65℃预杂交过夜。
9. 杂交 按2500px2膜用2.5ml杂交液，杂交时偶尔摇动杂交袋，使里面的溶液重新分配。
杂交液组成： 50%甲酰胺（V/V）
5%（W/V）封闭试剂
5×SSC
0.1（W/V）N-十二烷酰肌氨酸钠
0.02%(W/V)SDS
新变性标记DNA（150ng/ml）
杂交液取代预杂交液，替换时膜不能干，成功地替换应是膜与塑料袋间形成一层杂交液膜。于42℃杂交过夜（16～20h）。
10. 洗膜 按2500px2膜用250ml洗膜液计算。
(1) 在室温下用2×SSC/0.1%（W/V）SDS溶液漂洗，5min，2次。
(2) 在65℃条件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。
(3) 在室温下用2×SSC溶液漂洗1次。
11. 免疫测定
(1) 配制溶液
缓冲液1：Tris-HCl(100mM);NaCl(150mM)pH7.5(20℃）
缓冲液2：0.5%(W/V)封阻试剂(管11),配制于缓冲液1中(封阻试剂不会快速溶解,因此应预早1h前配制此溶液,将试剂溶于50～70℃,此溶液保持混浊)。
缓冲液3：Tris-HCI(100mM);NaCI(100mM);MgCI2(500mM)pH9.5(20℃)。
缓冲液4：Tris-HCl(10mM);EDTA(1mM);pH8.0(20℃)
显色溶液：新鲜配制，在10ml缓冲液3中，加45µl NBT溶液（管9）和35µl X-磷酸盐缓冲液。
(2) 显色过程
A．膜在缓冲液1中短暂洗涤（1min）。
B．在100ml缓冲2中保温30min。
C．再用缓冲液1短暂洗涤。
D. 用缓冲液1稀释的抗体结合物至150U/L(1:5000);稀释后的抗体结合物在4℃只能稳定12h。
E. 膜在20ml稀释的抗体结合物溶液中保温30min。
F. 用100ml缓冲液1洗膜,以除去未结合的抗体结合物,15min,2次。
G. 膜在缓冲液3中平衡2min。
H. 在黑暗条件下,膜与10ml显色溶液放入塑料袋内密封或放入合适的盒子内,几分钟内开始出现颜色,一般显色反应在1天后全部完成。当颜色显现时，不可振荡或搅拌。
I．当要求的点或带已被检测时，可用50ml缓冲液4洗膜5min终止反应。
J．摄相。
说明：上述各反应均在室温下进行，除了显色反应外，均需振荡或搅拌。
注意事项
1. DNA不能有效地被标记时考虑
(1) 用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀，重新纯化DNA。
(2) 标记反应的保温时间延长（增至20h）。
(3) DNA变性或许不完全，这时对大片段DNA特别重要。
2. 不能达到预期的灵敏度时考虑
(1) DNA标记率。
(2) 增加标记DNA的浓度或增加杂交时间。
(3) 显色反应的时间可延长至3天。
3. 若显色时背景过深，可采取
(1) 在杂交溶液中减少标记DNA量。
(2) 增加杂交溶液的体积，使膜随意漂浮在溶液中。
(3) 某些类型的尼龙膜可能产生深色背景，因此可采用其它类型的尼龙膜或改用硝酸纤维素膜。
(4) 在杂交和检测过程中增加封阻试剂的浓度。
