噬菌体抗体ELISA
实验概要
噬菌体ELISA是一种快速而便捷的方法，尤其是因为pⅧ有多拷贝会导致信号的扩增。
主要试剂
1. 2％MPBS
2. PBS/Tween
3. 辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗噬菌体单克隆抗体(mAb)(Amer Sham BiOSCiences)
4. 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)液体底物系统(SigmaT—8665)
5. 终止液(1mol/L H2SO4)
主要设备
96孔ELISA板，例如Nunc maxisorb442404(可自VWR购得)
实验材料
噬菌体样品
实验步骤
1．按每孔100ul蛋白抗原包被微量滴定板，4℃过夜。PBS中10ug/m1的浓度是包被抗原的标准浓度。但有时需要更高的浓度或者不同的包被缓冲液(比如碳酸盐缓冲液)。
2．弃去抗原液并用PBS洗涤板孔2次。
3．加入200wl的2％MPBS封闭板孔，37℃孵育2小时。
4．用PBS洗涤板孔 3次。
5．每孔加入50ul的4％MPBS。
6．每孔加入50ul含噬菌体抗体的培养基上清，用移液器反复吹吸混匀，室温孵育1小时。
7．弃去溶液，用PBS/Tween洗涤板孔3次，再用PBS洗涤3次。
8．将HRP标记的小鼠抗噬菌体单抗用2％MPBS按照1：5000稀释后，每孔加入100ul；室温孵育1小时。
9．弃去二抗，并用PBS/Tween和PBS分别洗涤3次。
10．每孔加入100ul TMB系统溶液，并在暗处室温孵育10～30分钟。数分钟内，应呈现蓝色。
11．每孔加入50～100ul终止液，终止反应。
12．在450nm处读板。
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