人25羟基维生素D3（25（OH）D3）实验原理
检测范围： 96T
0.6μg/L -16μg/L
使用目的：
本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中25羟基维生素D3（25(OH)D3）含量。
实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人25羟基维生素D3（25(OH)D3）水平。用纯化的人25羟基维生素D3（25(OH)D3）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入25羟基维生素D3（25(OH)D3），再与HRP标记的25羟基维生素D3（25(OH)D3）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的25羟基维生素D3（25(OH)D3）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人25羟基维生素D3（25(OH)D3）浓度。
人25羟基维生素D3（25(OH)D3）实验原理试剂盒组成：
1 30倍浓缩洗涤液 20ml×1瓶 7 终止液 6ml×1瓶
2 酶标试剂 6ml×1瓶 8 标准品（32μg/L） 0.5ml×1瓶
3 酶标包被板 12孔×8条 9 标准品稀释液 1.5ml×1瓶
4 样品稀释液 6ml×1瓶 10 说明书 1份
5 显色剂A液 6ml×1瓶 11 封板膜 2张
6 显色剂B液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1个
标本要求：
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤：
标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
16μg/L 5号标准品 150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液
8μg/L 4号标准品 150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液
4μg/L 3号标准品 150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液
2μg/L 2号标准品 150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液
1μg/L 1号标准品 150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
计算：
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
