RNA琼脂糖变性胶电泳分析
一、原理
RNA分子是以单链形式存在的，但在局部仍有双链结构形成。由于这种局部双链结构的干扰，使得在非变性凝胶上对RNA分子完整性的鉴定及其分子量大小的检测，变得不十分可靠。通过加入乙二醛一二甲基亚砜、氢氧化甲基汞、甲醛等变性剂进行变性处理，使其局部双链变为单链。再进行电泳，RNA的泳动距离与其片段大小的对数值就形成良好的线性关系，从而可对RNA的分子大小及完整性程度作准确的分析。
二、目的
了解琼脂糖变性胶电泳的原理和用途，掌握利用变性凝胶分析RNA的基本方法。
三、材料、试剂和仪器
1、已制备的植物RNA或其他RNA样品。
2、10×MOPS：0.4M MOPS, 100mM 醋酸钠，10mMEDTA，pH 7.0。
3、电极缓冲液：1×MOPS。
4、甲醛。
5、去离子甲酰胺。
6、加样缓冲液：50％（W／V）甘油，1mM EDTA(pH 8.0), 0.25%(W/V)溴酚蓝，0.25%（W/V）二甲苯青。
7、分子量标准参照物。
8、琼脂糖。
9、无菌重蒸水。
10、水浴锅。
四、操作方法
（一）琼脂糖变性胶制备
1、将电泳槽、胶模及样品梳先在3％H2O2中浸泡10－30分钟，在后用无菌无RNase的双蒸水彻底冲洗，干燥备用。
2、取一个干净的250ml三角瓶，加入40ml无菌双蒸水和0.5g琼脂糖，在微波炉或沸水浴上加热使琼脂糖彻底融化。
3、待融化的琼脂糖冷却至60℃－70℃时，依次加入9ml甲醛、5ml MOPS缓冲液和0.5ul溴化乙锭，轻轻摇动混合均匀。
4、将胶模两端的开口用胶带封好，水平放置在桌面上，在一端放上样品梳，梳齿高于底板0.5-1mm。
5、将凝胶溶液倒在胶模上，厚度3－5mm，室温放置30分钟，使胶完全固化。
6、撕去两端的胶带, 将胶模放在样品槽中。加入1×的MOPS电泳缓冲液，液面高出胶面1－2mm，从胶上小心拔出样品梳，检查样品孔是否完整。
（二）样品处理
1、取一个DEPC处理过的微量离心管，依次加入10×MOPS 2ul，甲醛3.5ul，去离子甲酰胺10ul，RNA样品4.5ul，混匀。
2、将离心管置于60℃水浴中保温10分钟，再在冰上静置2分钟。
3、加入3ul上样缓冲液，混匀。
（三）电泳
1、用20ul加样枪将上述样品加到样品孔内。同时加分子标准作为参照。
2、加样端接负极，另一端接正极。于7.5V/cm电压下电泳，当溴酚兰泳动至凝胶的3／4距离时，停止电泳。
3、紫外检测仪下观察和照相。在紫外检测仪下观察，完整的总RNA样品应呈现三条带，即28S、18S、和5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应该为18S rRNA条带的两倍。反之，说明部分28S
rRNA已经降解成18S rRNA。若无清晰条带，则说明样品RNA已严重降解；若加样孔内或孔附近有荧光区带，则说明有DNA污染。
