本方案和方案 4 是以变性质粒 DNA 为模板，使用两条寡核苷酸和高保真聚合酶引导 DNA 合成。本方案中，经多轮热循环全长双链质粒 DNA 将以线性形式扩增，产生一种 DNA 双链上带交错缺口的突变质粒（Hemsleyetal.1989)。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。
| 实验材料 | 带 hsdR17 基因型的感受态大肠杆菌菌株 |
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| 试剂、试剂盒 | ATP含有四种 dNTF 的混合溶液诱变缓沖液NaOHNaACTE噬菌体 T4DNA 连接酶噬菌体 T4 多核苷酸激酶DpnI 限制性内切酶热稳定 DNA 聚合酶琼脂糖凝胶寡核苷酸引物质粒 DNA |
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| 仪器、耗材 | 带障蔽的自动微量移液器用吸头微型离心管微量滴定板可调式移液器能设定所需扩墻参数的热循环仪 |
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| 实验步骤 | 材料
缓冲液和溶液
贮存液，缓冲液和试剂的成分请参阅附录 1。
将贮存液稀释到合适的浓度。
ATP(10 mmol/L)
含有四种 dNTF 的混合溶液，每一种 dNTP 浓度为 5 mmol/L
10X 长 PCR 缓冲液（用于混合的 DNA 聚合酶）
500 mmol/L Tris-Cl(室温下 pH9.0)
160 mmol/L 硫酸按
25 mmol/L MgCl2
1.5 mg/ml BSA
由厂商提供的缓冲液和热稳定 DNA 聚合酶缓冲液可替代上述缓冲液。
或
10x 诱变缓沖液（适宜用于 Pfu 聚合酶类似产品）
100 mmol/L KCl
100 mmol/L 硫酸铵
200 mmol/L Tris(pH8.9 在室温下)
20 mmol/L MgSO4
1%Tirton X-100
1 mg/ml 无核酸酸的 BSA
NaOH(1mol/L）/EDTA(1mmol/L)(选用）
NaAC(3mol/L，PH4.8)(选用）
该溶液用做中和试剂，因此 pH 值稍低于正常分子克隆中使用的 NaAC 溶液。
TE(pH8.0)
酶和缓冲液
噬菌体 T4DNA 连接酶（选用）
噬菌体 T4 多核苷酸激酶（选用）
DpnI 限制性内切酶
热稳定 DNA 聚合酶（例如，PfuDNA 聚合酶）
本方案所述工作条件适合于 Pfu Turbo DNA 聚合酶。然而这一工作条件也可适合于其他热稳定 DNA 聚合酶或聚合酶混合物。Stratagene 公司销售的 Pfu 有三种形式：天然产生的由克隆的基因表达生产的重组酶以及由重组 PfuDNA 聚合酶和一个新的特性未知的但能够提髙扩增产物的产量而不改变 DNA 扩增精确度的热稳定_因子组成的 PfuTurbo 酶。厂商声称 Turbo DNA 聚合酶能够扩增长度为 15kb 的 DNA 片段。按我们的经验，当双链质粒 DNA 的长度超出 7~8kb 时扩增效率降低。
凝胶
含 0.5% 溴化乙锭的 1% 的琼脂糖凝胶。
请见歩骤 8。
核酸和寡核苷酸
寡核苷酸引物
关于寡核苷酸引物设计的建议请见本方案介绍和信息栏中关于诱变寡核苷酸的相关内容。如果用 FPLC 和 PAGE 纯化寡核苷酸引物降低盐类污染水平会得到最好的结果（请见第 10 章方案 1 或 5）。将纯化后的引物以 20 mmol/L 浓度溶于水中。
质粒 DNA
用于诱变的模板 DNA 是含有目的基因或 cDNA 的环状质粒。通常质粒越小靶 DNA 扩增效率越髙。小于 7kb 的质粒扩增效率较高；然而长度为 11.5kb 的质粒也已被成功的用做 DNA 模板。质粒 DNA 以 1ug/ml 的浓度洧于含低浓度 EDTA(<0.1 mmol/L) 的 1 mmol/L Tris-Cl 中。
专用设备
带障蔽的自动微量移液器用吸头
微型离心管（扩增用 0.5 ml 薄壁管）或微量滴定板
可调式移液器
能设定所需扩墻参数的热循环仪
如果热循环仪不带加热盖装置，使用矿物油或石蜡油防止 PCR 过程中液体蒸发。
其他试剂
本方案步骤 14 需要的试剂列在第 1 章方案 23 中。
本方案步骤 15 需要的试剂列在第 1 章方案 1 中。
本方案步骤 16 需要的试剂列在第 12 章方案 3,4 或 5 中。
载体和细菌菌株
请见附录 3。
带 hsdR17 基因型的感受态大肠杆菌菌株（例如，XLl-Blue，XL2-Blue MRF'或 DH5a)
方法
用诱变引物扩增靶 DNA
步骤 1 和 2 可做可不做（请见步骤 3 后的注释)。
1. 将 1~10ug 质粒 DNA 溶于 40ul H20 中，再加入 10ul 1mol/L NaOH/1 mmol/LEDTA 溶液。37°C 孵育 15 min 变性质粒 DNA 模板。
2. 加入 5ul3mol/L(pH4.8) 中和上述反应液，再加入 150ul 预冷的乙醇沉淀 DNA。
3. 在微型离心机上 4°C 离心 10 min 收集变性的质粒 DNA。小心弃去乙醇上清，用 150ul 70% 乙醇清洗沉淀物。重新离心 2 min 后弃上清，室温下使所有的乙醇蒸发。将 DNA 重新混悬在 20ul 水中。
理论上不需要将质粒 DNA 模板变性。如果忽略碱变性步骤，超螺旋的天然双链 DNA 将在 PCR 的第一次循环过程中经 94°C 加热变性。需要步骤 1 和 2 的原因是由于质粒 DNA 在碱性环境中变性后所处的状态。在 0.2mol/LNaH 溶液中. 质粒 DNA 可折叠成高密度不可逆的变性状态，用这样的质粒 DNA 做 PCR 模板. 转化细菌的可能性极小。因此大大降低了含未突变野生型 DNA 克隆的背最（Du et al.1995,Dorrell et al.1996)。相比而言，尽管 PCR 第一个循环 95°C 的温度打破了 DNA 双螺旋结构，但并没有必定摧毀质粒 DNA 的转化能力。未经突变的亲本质粒 DNA 分子在转化后获得的克隆中含有较高的比例。直到实验的后期，当研究人员面临筛选克隆、鉴定含有突变 DNA 的任务时，碱变性的意义才显示出来。如果诱变效率低，且 Dpn Ⅰ筛选无效时，含野生型 DNA 分子充隆的比例之髙往往是无法接受的。
4. 用 0.5 ml 的无菌微量离心管，设置一系列含有不同量（例如 5,10,25,50ng) 质粒 DNA 和恒定数量的两种寡核苷酸引物。
10X 诱变缓冲液 5ul
模板质粒 DNA 5~50ng
寡核苷酸引物 1（20 mmol/L) 2.5ul
寡核苷酸引物 2(20 mmol/L) 2.5ul
dNTP 混合物 2.5ul
加水至 50ul
加入 2.5 单位的 Pfu Turbo DNA 聚合酶。
注意按以上次序加入试剂，以减少由 Pfu Turbo 3‘-5'外切核酸酶活性产生的引物的降解。
5. 如果热循环仪没有加热盖，加入 1 滴（约 50ul) 轻矿物油或 1 滴石蜡覆盖反应混合物，防止样品在反复加热和冷却循环过程中蒸发。将离心管放置在热循环仪中。
6. 用表中列出的变性、退火、聚合时间和温度条件进行扩增。
注：以上时间适用于 0.5 ml 薄壁管和反应体系，在 Perkin-Elmer 9600 或 9700 型，Master Cycler(Eppendorf), 或 PTC100(MJ Research) 热循环仅上孵育。若使用其他类型的设备和反应体系，需要调整反应需要的时间和温度。
单碱基置换反应需要采用 12 个循环进行线性扩增；单个氨基酸置换（通常相临的两至三个碱基罝换）使用 16 个循环；插入或缺失任何大小的 DNA 片段. 使用 18 个循环。
P/u 在扩增反应中催化的 DNA 合成速率比 Taq 慢 1.5~2.0 倍。
使用少量循环次数和大量起始模板，可以降低质粒 DNA、基因或 cDNA 在扩增过程中产生的假突变。
7.DNA 扩增反应完成后，需将反应产物置于冰上。
8. 从每一份扩增反应中取出 10ul 反应产物，通过 1% 的琼脂糖凝胶（含 O.5ug/ml 溴化乙锭）电泳检査靶 DNA 扩增情况。按照常规取 50ng 未扩增的线状质粒 DNA 和 1kbDNA 梯度分子量标准为参照物。
如果扩增效率低，设计--系列反应，优化出适当的循环参数和扩增反应所需成分的最佳量。
扩增产物的连接和转化
步骤 9~12 可做可不做，通常只用于诱变效率低时（例如当构建插入或缺失时)。
9. 用苯酚: 氯仿抽提扩增 DNA 两次，乙醇沉淀。
10. 将 DNA 重新悬浮在：
10X 噬菌体 T4 多核苷酸激酶缓冲液 5ul
10 mmol/L ATP 5ul
噬菌体 T4 多核苷酸激酶 5 单位
加水至 50ul
37°C 孵育反应1h,68°C 加热 10 min 灭活激酶。用酚: 氯仿抽提磷酸化的 DNA 两次，乙醇沉淀收集 DNA。
11. 把上述磷酸化的 DNA 沉淀（每种大约 0.9ug）重悬在 90ul TE 中。设计一系列磷酸化 DNA 浓度范围在 0.1~1ug/ml 的连接反应。
磷酸化的 DNA (10 至 100ng)
10x 噬菌体 T4DNA 连接酶缓冲液 10ul
10 mmol/LATP 10ul
噬菌体 T4DNA 连接酶 4 单位
加水至 100ul
16°C 孵育反应 12~16 h。
如果厂商提供的 10X 噬菌体 T4 连接酶已含有 ATP。省去上述连接反应中的 ATP 成分。
尽管理论上已弄懂了有利于环状单体形成的连接反应条件（Collins and Welssman 1984), 但实际上却很难做到。为了有利于形成分子内环化而不是分子间以链状连接，DNA 分子的摩尔浓度必须很低。然而当使用反向 PCR 扩增产生 DNA 时，因为无法得知末端未受损伤的全长 DNA 在 PCR 产物中的比例，因此很难计算出适当的 DNA 浓度。
12. 苯酚: 氯仿抽提 DNA 连接产物两次，乙醇沉淀收集 DNA。将 DNA 沉淀重悬在 45ul 水中，每管加入 5ul l0 倍的 DpnⅠ缓冲液。
13. 直接加入 10 单位 DpnⅠ至步骤 7 剩余的扩增反应物中，或加入到步骤 12 磷酸化和连接的 DNA 中以消化 DNA。用移液器上下吸打几次将试剂混匀。在微型离心机中离心 5s,37°C 孵育 1 h。
如果 PCR 反应是在存在矿物油或石蜡油的情况下进行，应注意一定要将 DpnⅠ加到反应混合物的水相中。使用带屏蔽的微最吸样器吸头，保证吸头的尖端插在矿物油或石蜡油覆盖层下边。
14. 按照第 1 章方案 23 描述的过程，分别取 1、2、5ul 消化的 DNA 转化大肠杆菌受体菌。
保证不要把矿物油从消化反应混合物带入到感受态细胞中。使用超级感受态大肠杆菌细胞 XL2-Blue MRF'(Stratagene) 及修改的转化过程有利于回收突变体转化的搡作过程（Dorrell et al.1996)。然而按我们的经验, 实验室自己制备的大肠杆菌感受态足可以用于大多数的环型诱变实验。
15. 从至少 12 个单独的转化子中制备质粒 DNA。然而如果突变导致一个新位点产生或毁坏或者把插入、缺失引进了模板，通过 DNA 序列分析，寡核苷酸杂交（方案 7) 或限制酶消化少量质粒 DNA 的方法筛选 DNA 突变体。
16. 序列分析全部的靶 DNA 片段，验证产生的预定突变体，而在扩增过程中有无假突变体生成（请见第 12 章方案 3,4,5)。
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