细菌的接合作用实验
细菌的接合是指供体菌与受体菌的完整细胞经直接接触时供菌的 DNA 向受体菌单向传递给而产生基因重组的现象。大肠杆菌的接合配对是由致育因子（ F 因子）的存在所决定的。没有 F 因子的细胞作为受体，称为 F-，含有 F+ 因子的细胞作为供体。 如果 F 因子是染色体外的细胞质遗传物质，这种细胞称为 F+。如果 F 因子整合到染色体上，这种细胞称为高频重组（Hfr，high-frequency recombination） 细胞，整合在染色体上的 F 因子有时也会通过不规则杂交而脱离染色体重新成为游离状态的 F 因子，但由于 F 因子在脱离染色体时往往会附带着一段染色体片段，这个染色体片段和 F 因子构成一个整体，随 F 因子一起复制，含有这种 F 因子的细胞叫作 F'。在 Hfr×F- 杂交中，F 因子上包括先导区在内的一部分 DNA 片段结合着染色体 DNA 向受体细胞转移，F 因子的大部分 DNA 处于转移染色体的末端。 而且转移过程中随时可以发生中断，因此接合后的 F- 细胞虽然接受了某些 Hfr 基因，但一般不可能接受 F 因子而成为 F＋状态。
| 实验方法原理 | 本实验采用的供体菌是大肠杆菌野生型 Hfr 菌株，对链霉素呈敏感性（Str3），受体菌为大肠杆菌营养块陷型突变体 （Thr-Leu-Thi-），需要苏氨酸，亮氨酸和硫胺素，对链霉索呈抗性 （Str3）。短期接合配对以后，在含有链霉素和硫胺素的基本培养基上只能分离到苏氨酸和亮氨酸的重组子 （Thr＋Leu+Thi-），硫胺素标记位于转移染色体的末端，在短期配对过程中因配对中断难以转移到受体细胞， 因此硫胺素是 Thr＋Leu+Thi- 重组子的必须生长因子。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 分别将供体菌和受体菌接种在 2 支盛有 5 ml LB 液的试管中。37℃ 振荡培养 12 h。 2. 分别用不同的 1 ml 无菌吸管吸取 0.3 ml 供体菌培养液和 1 ml 受体菌培养液至同一无菌试管中。 受体菌是过量的，这样可以保证毎一个供休菌有相同的机会和受体菌接。 3. 用两只手掌轻轻搓转试管，使试管内供、受体菌混匀。 动作要轻柔，使供体菌和受体菌充分接触，同时避免刚接触的配对又被分开。 4. 将供、受体菌混合培养物置 37℃ 保温 30 min。 5. 3 个链霉索硫胺素固体培养基平板，冷凝后，用玻璃记号笔分别作好标记，2 个平板分别用于供体菌和受体菌作为对照，第 3 个平板用于供、受体菌混合培养物。 6. 吸取 0.1 ml 供体菌放到一个作好标记的对照平板上，用无菌的玻璃涂棒将平板上的供体菌液涂布到整个平板表面，同样吸取 0.1 ml 受体菌涂布到另一个作好标记的对照平板上。 7. 供、受体菌混合培养物保温 30 min 后，将这支试管剧烈振荡。 动作要剧烈，可用振荡混合器振荡几秒钟，使供休菌和受体菌之间的性菌毛断开，从而中止基因的遣传转移。 8. 吸取 0.1 ml 混合培养物，如上述方法涂布到作好标记的平板上。 9. 将所有的平板倒置于 37℃ 培养 48 h。 展开 |
