细菌接合与基因定位———中断杂交
实验方法原理 在大肠杆菌细胞内,F因子与染色体DNA之间的交换可使F因子插入到宿主细胞的染色体DNA中。带有一个整合F因子的细胞称为高频重组(Hfr)细胞。不同的Hfr菌株中F因子的整合的位置不尽相同。在Hfr细菌和F-接合中,Hfr细胞染色体可以进入F-细胞,发生重组。Hfr细菌中染色体的转移从F因子的末端开始,而且在转移的过程中可随时发生中断。因此,接合后的F-细菌虽然接受了某些Hfr基因,但是一般不能接受F因子使之成为Hfr或F+状态。由于染色体的转移具有方向性并且随时中断,处在前端的Hfr基因有更多的机会出现在F-细菌中,越位于后端的基因转入F-细胞的机会越少。因此,根据接合后F-细菌中Hfr基因出现的多少(即重组子的多少)便可以知道这些基因转移的先后顺序。由此可见,可以通过梯度转移方法测定基因在染色体上的相对位置,即基因在染色体上的排列顺序。
实验材料 供体菌 : 大肠杆菌 ( Escherichia coli) CSH60: Hfr sup 受体菌 : 大肠杆菌 ( E . coli) FD1004: F - leu purE trp his met A ilv arg thi ara lacY x yl m tl gal T6 r rif r strr
试剂、试剂盒 LB培养液A～D固体基本培养基(每组选用一种6皿)半固体琼脂无菌生理盐水
仪器、耗材 恒温培养箱 振荡混合器 高压灭菌锅 培养皿 三角瓶 移液管 试管
实验步骤
1.分别将供体菌和受体菌接种在5ml LB液体中,37℃振荡培养过夜。
2.将培养过夜的供体菌和受体菌各按1∶5的比例转入另外稀释的5ml LB液中,37℃继续培养2～3h。
3.分别取0.2ml供体菌和4ml受体菌混合在一个150ml无菌三角瓶中,置37℃水浴轻轻摇动(50～100r/min)。
4.分别在培养0min、10min、20min、30min、40min、50min时将上述混合菌液吸0.2ml于盛有10ml无菌生理盐水大试管中,立即用振荡混合器剧烈振荡30s,然后取0.2ml于3ml半固体培养基中用振荡混合器混合5s,倒在选择平板上铺平(每个实验小组可选用其中一种选择性培养基),同时取供体菌和受体菌作为对照(以后取样测定不需要再做对照),待凝固后置37℃培养过夜。
