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质粒DNA的小量制备实验——96孔微量滴定板碱裂解法

2019.3.26

质粒DNA的小量制备用于抽提微克级的质粒DNA,主要有碱裂解法、96孔微量滴定板碱裂解法、煮沸小量制备法。


实验方法原理当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后,质粒DNA分子能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状,离心时可沉淀下来。这个方案可以在一天内快速制备数以百计的质粒。
实验材料

细菌克隆

试剂、试剂盒

TYGPN培养液异丙醇

仪器、耗材

96孔微量滴定板多道加样器多管涡旋混合器低速离心机

实验步骤

1.  在96孔微量滴定板上每孔中加人0.3 ml TYGPN培养液,每孔中接种一个含有质粒的单菌落,于37°C培养至饱和状态(约48 h)。

2.  饱和培养液于4°C,以600 g用带有微孔板卡槽的H-1000 B转子离心10 min,轻轻甩去每孔中的上清液。

3.  将平板夹在多管涡旋混合器上置4挡振荡20 s,重悬细菌。

4.  每孔先加人50 μl GTE溶液,再加人100 μl NaOH/SDS溶液,放置2 min。

5.  每孔加人50 μl 乙酸钟溶液,盖上盖子或封口膜(Parafilm)。

6.  于涡旋混合器上置4挡剧烈振荡20 s,然后于4°C,600 g离心5 min。

7.  用枪头插人孔底的U字型的壁底,从每孔吸取200上清液至另一块新的平板中。

8.  在新板每孔中加入150 μl异丙醇,盖好盖子,振动混匀,于-20°C冷冻30 min。

9.  于4°C,600 g离心25 min,弃上清。用冰冷的70%乙醇洗涤沉淀,轻轻吸去上清,再用95%乙醇洗涤,同样轻轻吸去上清。

10.  空气中干燥30 min后用50 μl TE重溶沉淀。于4°C短期保存,于-20°C或-70°C 长期保存。并每孔取10 μl进行分析。



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