科研中的尖兵利器浅析——共聚焦篇（上）
在科研的战场上，你是否还在苦于寻找更出色的成像技术与手段？你是否还在纠结观察到的实验现象能否真实的反映样品的情况？你是否还在为图像质量差而不能发表高质量的论文而苦恼？“工欲善其事必先利其器”，共聚焦将为你更好的解决这些问题。
与传统的宽场成像相比，共聚焦作为一种高端的显微成像术，以其出色的成像质量及三维重构能力，俨然已成为一种主流的成像方式。接下来小编将带你进入共聚焦的世界，为你浅析共聚焦的基本原理及其在生物研究领域的应用。
共聚焦原理
激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）利用放置在光源（激光）后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔（pinhole）实现点照明和点探测，光源通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔内，焦平面以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。因此，通过共聚焦能够清晰地获得焦平面上的荧光信号。
图1 左右两边分别是普通宽场显微镜和共聚焦显微镜的成像光路，共聚焦显微镜利用点探测和点照明技术获得高清晰度的图像。
计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。随着载物台沿Z轴上下移动，样品的新层面又成像在显示器上，这样就可得到样品不同层面的连续光切图像(Z-stack)，进一步通过三维重构就能获得样品精确的三维信息。
图2 左：共聚焦显微镜的点扫描及Z轴层切模式；右：通过共聚焦显微术对视网膜神经元进行三维重构。
共聚焦应用
相对于普通宽场成像，共聚焦能获得高分辨率高清晰度的三维图像，因此其应用范围更广，接下来小编将介绍共聚焦显微镜在生物研究领域的几点重要应用。
荧光定位及三维重建
激光共聚焦显微镜最重要的应用莫过于荧光定位的观察与三维重构。通过荧光定位观察可以得知感兴趣的蛋白在细胞或组织中的定位情况，而结合对细胞器或细胞骨架等结构进行标记可以得到该蛋白的亚细胞定位，通过与其他蛋白进行双色或多色共染可以分析两个或多个蛋白的共定位情况。
图3 左: 通过共聚焦显微镜对细胞微丝骨架（绿色，phalloidin）及线粒体（红色，mitrotracker）结构的清晰成像；右：通过共聚焦显微镜对果蝇卵结构的三维重构。
共聚焦通过点扫描对样品进行成像，通过不断移动Z轴实现对样品的三维层切并通过三维重构获得样品精确的三维信息（被称为“细胞 CT”），进而可以更准确地在Z轴上分析蛋白的定位情况。
荧光定量及共定位分析
如果你要对样品的荧光信号进行定量，那么通过徕卡共聚焦显微镜操作软件可以轻松达到这一目的，操作简便快捷。
图4 通过共聚焦软件对荧光信号进行定量：选中quantify-intensity-stack profile选项，通过ROI工具框选待分析区域，在窗口中间即显示所选区域的所有信息，包括荧光通道、平均荧光
如果你要对两个或多个信号进行共定位分析，我们的软件也应对自如。
