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科研中的尖兵利器浅析——共聚焦篇（下）

2020.5.12

图5 通过共聚焦软件对荧光信号共定位情况进行分析：选中quantify-colocalization选项，通过ROI工具框选待分析区域，在窗口中间即显示所选两个通道的共定位参数，包括Pearson系数、共定位比率等。

多点扫描及拼图

假如你的样品需要拍摄大视野而同时又需要高分辨率怎么办呢?不用着急，我们的软件里有自动拼图功能，你只需要设置好所拍摄视野对角线上的两个端点，软件便会自动进行运算并进行自动拼图拍摄。同样的，如果你不需要拼图，仅需要拍摄多点，我们的软件也可以轻松帮你实现。

图6 自动拼图（左）和多点成像（右）模式。

图7 对小鼠鼻腔层断面的大视野高清晰度拼图。左：48个视野的自动拼图（40倍物镜），右：对左图中框选区域的放大。

活体成像

共聚焦不仅能对固定样品进行成像，对活细胞或组织样品进行成像也是小菜一碟，只要你设置好相关参数就可以轻松拍摄了。当然，活体拍摄过程中维持样品活性的条件是要保证的，如细胞培养的温度、湿度及二氧化碳浓度等，这都可以通过选择共聚焦显微镜相关配件轻松实现。这样你就可以通过活体拍摄追踪细胞增殖、细胞运动、细胞骨架动态变化、细胞内钙离子信号变化等生命过程了。

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视频1 对COS7细胞中微管结构进行共聚焦活体成像，共拍摄5分钟，时间间隔5秒。
（Courtesy: Dr. Yasushi Okada, University of Tokyo）

高级应用

a . 光谱测量

在开发新的荧光蛋白/染料或对植物叶片等自发荧光较强的样品成像时，荧光蛋白/染料的激发和发射光谱就显得尤其重要。通过共聚焦这一利器能轻松实现对荧光蛋白/染料发射光谱的扫描，而配备最新的白激光激光器后，荧光蛋白/染料激发和发射光谱的同时扫描在分分钟内就能轻松搞定。

图8 通过白激光激光器对六色荧光小球样品激发和发射光谱的同时扫描。

b . FRAP

（Fluorescence Recovery After Photobleaching）

借助于高强度激光照射细胞的某一区域使该区域荧光分子发生光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，用激光扫描共聚焦显微镜可直接对此扩散速率进行检测，由此可以研究生物膜流动性、细胞骨架动力学、细胞内及细胞间的物质交流等。

图9 荧光漂白恢复技术（FRAP的实现过程。

c . FRET

（Förster resonance energy transfer）

荧光共振能量转移发生在供体荧光分子与受体荧光分子的距离足够近且供体的发射光谱与受体的吸收光谱相重叠时（10nm以内）。当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过共振实现能量向邻近受体分子转移的现象。发生FRET后，供体的荧光强度比它单独存在时要低的多，而受体发射的荧光却大大增强。通过FRET可以检测分子间的相互作用及分子的折叠与构象变化。

图10荧光共振能量转移技术（FRET）的原理。

以上高级功能的应用都可通过选择拍摄软件中的相应模块快速的实现。

小结

共聚焦显微镜作为科研中的尖兵利器，其应用还远不止上面提到的这些。而徕卡新一代顶级共聚焦显微镜Leica TCS SP8 X配备了白激光激光器（独有的AOBS分光系统）、棱镜分光狭缝检测系统、AFC自动对焦装置、超高灵敏检测器HyD（配合白激光可实现高清晰度高分辨率的门控成像）、Hyvolution图像处理软件（通过反卷积处理可达到130nm高分辨率）等，能轻松实现以上所有应用。同时，其强大的扩展性使SP8能轻而易举升级为STED超高分辨率显微镜、MP多光子成像系统、Hi speed高速扫描系统等进而实现更多更强大的应用，可以说SP8 X共聚焦显微镜作为科研界的尖兵利器当之无愧。

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