高灵敏度量子点与单域抗体偶联产物检测肺癌和...（一）
高灵敏度量子点与单域抗体偶联产物检测肺癌和乳腺癌肿瘤生物标志物HER2的研究
文献概述：
癌症即恶性肿瘤，被认为是不治之症，但如果能将癌症或恶性肿瘤在发病早期诊断出来，就可以争取时间，及早治疗，从而大大提高癌症患者的存活率。虽然免疫组织化学等方法已经广泛应用于癌症生物标志物的检测中，但该方法干扰因素多，敏感性较低，癌症阶段判断性不强等缺点，极易导致误诊。随着纳米生物技术的飞速发展，新型半导体纳米晶体量子点逐步应用到生物医学领域，该技术与肿瘤生物标志物的结合，将对癌症的发病机理研究、早期诊断、靶向治疗以及预后复发检测产生积极影响。
本文介绍了一种基于量子点与抗人表皮生长因子受体2(HER2)的单域抗体（sdAbs）偶联生成超小发光纳米探针的方法，并将其成功应用于检测肺癌和乳腺癌肿瘤细胞。研究人员首先模拟了体外肿瘤细胞生长的微环境，利用微环境培育不同的肺癌和乳腺癌细胞系，运用Western Blot以及ELISA实验获得不同HER2表达水平的肺癌和乳腺癌细胞系。接着采用基因工程抗体的方法制备HER2单域抗体（见图1）：将生物标志物HER2免疫羊驼，取羊驼血清中的淋巴细胞获取RNA，构建噬菌体抗体库，通过ELISA筛选获得活性高的抗HER2的单域抗体，最后通过测序获得单域抗体可变区的序列。通过延伸PCR，构建含有his-tag和cys的单域抗体（图2），通过原核表达获得工程化的sdAbs-SH。然后通过4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（sulfo-SMCC）或N-(p-马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯（PMPI）两种方式将sdAbs-SH与修饰氨基或羧基的量子点偶联（图3）。最后，用sdAbs-QDs偶联物检测微环境中培育的不同HER2表达水平的肺癌和乳腺癌细胞，通过激光共聚焦显微镜观察肺癌和乳腺癌的染色情况，并应用流式细胞仪进行检测分析（图5）。文章证实与传统的有机染料Alexa Fluor 488、568相比，在不同HER2表达水平的肺癌和乳腺癌细胞检测中，sdAbs-QDs偶联物的染色效果具有明显的优越性。
研究者利用sdAbs-QDs偶联物能够检测到癌症细胞低水平表达的HER2，这种检测方法兼具量子点优良荧光特性和超小单域抗体极强的穿透性，从而大大提高了检测的灵敏度。该项技术将极大的推动QDs作为标记探针在癌症研究和诊断方面的应用。该文发表于ACS NANO杂志上。
图1：单域抗体制备过程图
（1）用感兴趣的抗原免疫羊驼。
（2）利用密度梯度离心法从血液回收外周血单核细胞。
（3）通过RT–PCR方法从总RNA反转录cDNA中扩增编码单域抗体的基因，并克隆到噬菌粒载体。
（4）将外源基因库sdAbs插入到外壳蛋白P3基因中，从而在辅助噬菌体的表面进行展示。
（5）sdAb噬菌体展示库用免疫抗原进行吸附，冲洗掉未结合的噬菌体，将结合的噬菌体洗脱进行富集；
（6）单克隆筛选鉴定；
（7）阳性噬菌体sdAbs感染非抑制型大肠埃希菌进行可溶性分泌表达，纯化，最后进行SDS–PAGE分析。
图2：带有his-tag和cys的单域抗体（sdAbs）
图3： (a)4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（sulfo-SMCC）和（b）N-(p-马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯（PMPI）与量子点偶联反应示意图
