核酸探针标记及原位杂交-1
一、核酸探针标记
核酸探针分子杂交是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。杂交的双方是待测核酸及探针。
核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针；根据标记物不同，可分为放射性标记探针和非放射性标记探针两大类；根据是否存在互补链，可分为单链和双链探针；根据放射性标记物掺入情况，可分为均匀标记和末端标记探针。下面主要介绍双链DNA探针及其标记方法和光敏生物素标记探针的方法。
(一)切口平移法(nick translation)标记双链DNA探针
当双链DNA分子的一条链上产生切口时，E.coli
DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3?蒺羟基末端。同时该酶具有从5?蒺→3?蒺的核酸外切酶活性，能从切口的5?蒺端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3?蒺端补上核苷酸，从而使切口沿着DNA链移动，用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50～500bp。切口平移反应受几种因素的影响：①
产物的比活性取决于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度；② DNA酶Ⅰ的用量和E.coli
DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小；③ DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性，故应使用仔细纯化后的DNA。
1.材料
（1） 设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。
（2） 试剂： ①10×切口平移缓冲液：0.5mol/L Tris·Cl(pH7.2)；0.1mol/L MgSO4；10mmol/L
DTT；100μg/ml BSA。②未标记的dNTP原液：除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外，其余3种分别溶解于50mmol/L Tris·Cl
(pH7.5)溶液中，浓度为0.3mmol/L。③[α-32P]dCTP或[α-32P]dATP 400 Ci/mmol, 10μCi/μl。④
E.coli DNA聚合酶Ⅰ(4U/μl)溶于50μg/ml BSA，1mmol/L DTT，50%甘油，50mmol/L
Tris·Cl(pH7.5)中。⑤DNA酶Ⅰ1mg/ml。⑥EDTA 200mmol/L(pH8.0)。⑦10mol/L NH4Ac。
2.方法
（1）按下列配比混合：未标记的dNTP 10μl、10×切口平移缓冲液5μl、待标记的DNA 1μg、[α-32P]dCTP或dATP(70μCi) 7μl、E.coli DNA聚合酶4U、DNA酶Ⅰ1μl，加水至终体积 50μl；
（2）置于15℃水浴60min；
（3）加入5μl EDTA终止反应；
（4）反应液中加入醋酸铵，使终浓度为0.5mol/L，加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。
3.注意事项
（1）3H、32P及35S标记的dNTP都可用于探针标记，但通常使用[α-32P]-dNTP。
（2）DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。
