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关于光合作用测量仪器必须知道的使用要点（二）

2021.3.08

—— 使用光合仪和荧光仪要注意什么？——

>> 光合仪 <<

1、预热！预热！预热！所有IRGA原理的光合仪都需要预热！不同品牌的光合仪预热时间不同，实际应用中预热的时间约为30-60分钟。

2、分析器调零，调零的目的是为了消除光合仪的检测误差。不同品牌，不同型号的光合仪，根据IRGA类型的不同，调零模式有差异。目前比较常见的是双通道四分析器光合仪，双通道是Reference和Sample两股气路通道，四分析器分别是H2O Reference分析器和CO2 Reference分析器，H2O Sample分析器和CO2 Sample分析器。在测量叶片前先测量分析器的读数差异并将其固定即视为调零，之后才可以进行气体交换的测量。

调零气路

测量气路

3、精确控制环境因子（光、温、水、气），光合仪主要采用开放式气路系统，即光合仪从环境中吸取空气，测量流经叶片前后CO2和H2O的浓度变化，测量后的气体从出气口流走。环境空气的温度，湿度，CO2浓度及环境的光强剧烈波动会严重影响光合仪的使用。因此建议在使用过程中精确控制环境因子。

4、原位测量，严禁离体，因为离体叶片生理状态会发生变化，最明显的就是气孔关闭。除了离体损伤之外，可能会导致气孔关闭的还有手上的汗液或化妆品残留等，所以不要直接用手擦拭叶片。

5、叶片面积（或重量），光合仪计算的光合速率是单位面积（或重量），单位时间内的CO2同化率，测量时需要已知的测量面积（或重量）。现在有些品牌的光合仪允许测量完成后修正测量面积（或重量），重新计算光合速率，如德国WALZ的GFS-3000。

6、叶片温度，叶片温度是计算光合参数和控制气体交换温度的重要依据。因为光合仪的测量原理默认叶肉细胞内为100% 相对湿度。

7、叶室气流流速，流经叶室的气流流速，与气体交换参数计算有关。光合能力弱的阴生植物可以尝试低流速测量。

8、日常维护，光合仪属于精密的气体分析仪器，为保证测量的准确性，应该定时做标定，标定程序分为CO2和H2O分析器零点标定和CO2和H2O分析器跨度标定。光合仪在环境因子控制过程中会消耗一些药品，如干燥剂和碱石灰等，使用前后要注意检查。光合仪作为野外便携式测量设备，时常会被带到野外去实验，使用中务必留意电池电量状况，及时保存数据，使用前后及时给电池充电。特别提醒，远离水源！

>> 荧光仪 <<

1、荧光仪的种类，目前常用的叶绿素荧光仪有两种，脉冲调制式的和连续激发式的。脉冲调制式的可以在有环境光为背景的情况下使用，连续激发式的不可以。但是连续激发式的时间分辨率比脉冲调制式的高。脉冲调制式的叶绿素荧光仪通常用来测量淬灭分析，快速光曲线等。连续激发式的通常用来做快相分析。

2、暗适应，为了更好的对叶绿素荧光测量进行合理的解释，如何定义光合机构在测量开始时的状态非常重要。所以，在大多数实验中，无论脉冲调制式还是连续激发式叶绿素荧光仪，测量前一般需要首先进行暗适应。叶片的暗适应状态是光合机构的基本状态。暗适应的方式有很多种，整株植物置于暗室，单个叶片放入暗适应夹，夜间测量。暗适应的时间长短取决于我们希望从叶绿素荧光中得到什么信息。例如，大田作物叶片光合能力评价，暗适应时间一般只需要30分钟。而实验室内拟南芥叶片跨膜质子梯度ΔpH的测量则需要几个小时甚至更长。

3、荧光仪光源，在荧光参数测量前对荧光仪光源有明确的认识是非常有必要的。以调制式的叶绿素荧光仪为例，通常会配置四种光，测量光ML，光化光AL，饱和脉冲光SP，远红光FR。测量光，光强比较弱（＜1μmolm-2s-1），具有调制频率，用于信号检测，测量前需要调整测量光强度(Int.)和频率(Freq.)使荧光信号达到基本检测要求。测量光强度过高， Fm 测定时可能会因为过饱和被低估，如果测量光强度太低，则不会使用满量程，误差增大。光化光，是诱导植物发生光合作用的光，又叫作用光。常见的荧光仪光化光光源有两种， 460nm左右的蓝光或630nm左右的红光。光化光的强度通常也是可以调节的，以适应不同的实验需求。但是请注意，光源出口与样品的距离会改变样品表面的光强。所以测量前务必明确到达样品表面的光强具体是多少。很多设备的出厂设置都是预设的，安装调试时最好执行光强校准，确保软件或者报告里的PAR值与样品水品的实际光强值一致。饱和脉冲，脉冲调制式荧光仪除了上述两种光还有一种饱和脉冲光，而连续激发式荧光仪通常只有饱和脉冲光。饱和脉冲在荧光仪中通常是用来计算数据的，光强比较强，一般都要大于3000μmolm-2s-1。为适应不同样品类型和实验要求，饱和脉冲的强度和持续时间通常也是可以调节的。远红光，有些品牌或型号的荧光仪还会搭载用于激发光系统Ⅰ的远红光，远红光可以用来测量Fo’，暗弛豫，状态转换。

4、Fv/Fm, (Fm-Fo)/Fm,最大光能转换效率，反应植物潜在的最大光合能力。通过测量暗适应之后的最小荧光Fo和最大荧光Fm计算而来。该参数相对独立，可以单独使用，来评估胁迫条件下植物的光合特性变化或用来筛选突变体。大多数荧光仪都可以测。

5、ΦPSII，(Fm’-F)/Fm’, 实际光能转换效率，反应植物在稳态下的实际光合能力，通过测量稳定环境（光温水汽）状态下的最小荧光F和最大荧光Fm’计算而来。可以在晴朗的天气，快速测量大量植物的光合特性。测量过程要同时采集环境参数，如光强，温度等。

6、诱导曲线，Induction Curve，慢速荧光诱导动力学（Slow Kinetics）的一种。测量诱导曲线可以获得淬灭分析（Quenching Analysis）的参数，光化学淬灭(qP), 非光化学淬灭(NPQ)。实际应用中，诱导曲线后可以增加暗弛豫的测量，进一步分析植物非光化学淬灭的能力。完整操作如下，先通过光化光诱导植物叶片达到稳态，测量光化学淬灭和非光化学淬灭。然后关闭光化光，打开远红光，继续测量，直到植物在暗处再次达到稳态，测量暗稳态下的荧光淬灭。谨记，诱导曲线的测量需要暗适应。

7、光曲线，Light Curve，测量不同光强下的量子产量，计算电子传递速率ETR（ETR=PAR*Yield*吸光系数*0.5）。光曲线是光响应曲线的一种表征方式，相对于光合仪测气体交换的A/Q曲线，荧光仪测量light Curve的时间可以短得多，所以又被称为快速光曲线(RLC)。光曲线可以拟合得到光能利用效率α，最大电子传递速率ETRmax，半饱和光强Ik，实现不同样品光合特性的对比。

8、荧光成像，普通的荧光仪通常以数据报告的形式呈现测量结果，而荧光成像则可以将数据图像化，直观的展现样品间的光合特性差异，极大地扩展了叶绿素荧光技术的应用。如今，荧光成像早已经成为光合生理研究，遗传育种，突变体筛选，病虫害早期检测的常用工具。相比于普通的荧光仪，荧光成像的测量面积大，全叶片成像有助于分析叶片的横向异质性。荧光成像并不是面积越大越好，比面积更重要的是成像区域光场的均一性。均匀的广场保证了叶片每一个部位的照光条件一致，实验结果才更可靠。所以荧光成像的光源布局要经过精心的的设计，就像手术台的无影灯，照亮每一个看得见的角落。