亲和层析实验
可溶性抗原或膜结合抗原的分离
实验材料 | 蛋白质 |
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试剂、试剂盒 | Tris TSA 裂解缓冲液 脱氧胆酸钠 洗涤缓冲液 三乙醇氨缓冲液 |
仪器、耗材 | 层析柱 离心管 离心机 |
实验步骤 |
1. 准备一支活化后被淬灭的Sepharose预柱(5 ml 柱床)和一支Ab-Spharose免疫亲和层析柱,并将它们串联起来。
4. 对于提纯膜抗原,在去细抱核的上清中加入0.2倍体积的5%脱氧胆酸钠,于水浴或 4℃放置10 min,转移至quick-seal离心管100 000 g 离心1 h,小心移出上清并保留之。
5. 将预柱连接于免疫亲和层析柱。
图一、免疫亲和层析柱
8. 用5倍体积的洗涤缓冲液洗柱子,然后关闭两根柱子的止水阀。拆离亲和柱与预柱的连接,打开亲和柱的止水阀,让柱床上面的液体流至柱床表面。
11. 以5倍体积的TSA溶液洗柱子。
12. 分析含抗原的洗脱液组分:每份洗脱液取50 μl SDS-PAGE银染分析。取0.5~ 1 ml 上柱样品和有代表性的穿透流出液及洗脱液以Ab-Sepharose免疫共沉淀,并接着进行SDS-PAGE和银染检测以确定柱子是否已被饱和。
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注意事项 |
在每次更换缓冲液时,按下述过程洗免疫亲和柱: 展开 |