ZIC-HILIC 法鉴定"皮革奶"
不法商家将皮革下脚料混入牛奶，用于提高蛋白质含量，称为“皮革奶”。因在皮革水解蛋白的生产过程中往往添加有重铬酸钾、重铬酸钠等化学物质，铬在后续处理过程中无法完全除去，如果长期食用添加了皮革水解蛋白的“皮革奶”，金属铬会被人体吸收，积累于骨骼之中，长期积累便会中毒，使人体关节疏松肿大，甚至造成儿童死亡。L- 羟脯氨酸(L-HYP)是动物水解蛋白中特异的成分，其含量占动物水解蛋白的10%以上，而乳蛋白中不含此成分，因此可以通过检测乳制品中L-羟脯氨酸的含量来判断是否添加了动物水解蛋白。
本文采用ZIC®-HILIC 色谱柱，建立了LC-MS/MS 方法用于监测“皮革奶”。两性离子- 亲水作用液相色谱(ZIC-HILIC)是在硅胶或聚合物表面键合了一个磺基甜菜碱结构的两性离子键合相。固定相表面会建立一个富集水的液体层，分析物在流动相和该水层之间进行分配，这是HILIC 中亲水分配的初级保留作用，在这个过程中，水层作为固定相的一部分参与分配。同时，这种固定相表面的离子能够与不同类型的离子型化合物产生静电作用，静电作用增加了亲水固定相的选择性。不过，如果化合物与固定相的静电作用太强，化合物不易洗脱，则需要采用高浓度的缓冲盐来调节，这样会抑制质谱信号，降低灵敏度。在两性离子固定相中，每个电荷的静电作用都会被邻近的反向电荷部分地平衡或抵消，因此，总的静电作用是比较弱的。较弱的静电作用允许流动相使用较低的缓冲盐浓度，这对提高质谱检测器的检测灵敏度是有利的。
仪器及试剂
色谱柱ZIC®-HILIC，PEEK HPLC Column 150×2.1 mm，5 μm，200 Å(默克密理博);Milli-Q Advantage 超纯水系统(默克密理博);液质联用仪Agilent1200-API 3200(AB Sciex)。
色谱用乙腈为LichroSolv® 梯度级别，乙酸铵、乙酸、盐酸、氢氧化钠等分析试剂均为EMSURE® 级(默克)。
实验方法
样品处理
取牛奶2.0 g，加10.6 mol/L 盐酸溶液6 ml，真空封管，于110 ℃下水解12 h。挥干溶剂，加水溶解，NaOH 溶液(1M/L)调节至中性，加水定容至25 ml。转入50 ml 离心管中，8000r/min 离心3 min，上清液用50 mmol/L 乙酸铵水溶液+ 乙腈(2+8)混合溶液稀释10 倍，过0.45 μm 微孔滤膜，滤液直接进高效液相色谱/ 串联质谱仪检测。
图1. L- 羟脯氨酸对照品（浓度为500μg/L）的典型色谱图（选择离子m/z:132，68，86）
图2. 牛奶样品加标（L- 羟脯氨酸800 ppb）典型色谱图（选择离子m/z:132，68，86）。
图3. 校准曲线。
测试条件
色谱条件：流动相(v/v)，A 为醋酸铵(50 mM，pH 5.6)，B 为乙腈;梯度：0 ~10 min 85 % ~ 85 % B，10 ~ 12 min 85 % ~55 % B，15~ 20min 55% ~ 55 % B;流速: 0.8 ml/min;进样量：2 μl ;柱温：25 ℃。
质谱条件：离子源，电喷雾离子源;扫描方式，正离子扫描;电喷雾电压(V)，5500;离子源温度(℃)，600;气帘气压力(Pa)，20 ;雾化气压力(Pa)，50 ;辅助气压力(Pa)，30 ;碰撞能量分别为22 和18V ;检测方式，多反应检测(MRM)，母离子(m/z)132.1，选择离子(m/z)86.0 和68.2。
图4. 某品牌牛奶样品的典型色谱图（选择离子m/z:132，68，86）
图5. 胶原蛋白样品的典型色谱图（选择离子m/z:132，68，86）。
结果与讨论
流动相及定量离子的选择
典型的HILIC 流动相需在水或挥发性缓冲液中含有40 % ~ 95 % 的乙腈。为获得好的分离重现性，流动相应至少保持3 % 的水，以确保固定相颗粒被充分地润湿。由于HILIC是一种在反相条件下进行的正相分离模式，因此增加流动相中的有机溶剂会提高溶质的保留时间，相反，提高流动相中水的比例，则会降低被分析物的保留时间。
为了改善化合物在亲水作用色谱中的分离效果，通常选用醋酸铵或甲酸铵作为缓冲盐添加到流动相中，乙酸、甲酸可以用来调节流动相的pH 值。磷酸盐也可以作为缓冲盐，但必须注意小心使用，避免有机相析出堵塞色谱柱甚至损坏仪器。使用85：15 的乙腈/ 水(pH=5.6)为流动相，流速为0.8 ml/min，L-羟脯氨酸对照品、空白牛奶样品加标的典型图谱见图1、图2。
在优化的色谱- 质谱条件下，m/z 132 为羟脯氨酸的准分子离子[M+H]+，m/z 86 和/m/z 68 为L- 羟脯氨酸的特征离子碎片。可采用特征的子离子与其他相同分子量的氨基酸(如亮氨酸)进行区分。本实验采用子离子m/z 86 进行定量。
表1. 精密度及回收率
线性关系、检测限和定量限
配制一些L- 羟脯氨酸对照品，在选定的色谱- 质谱条件下分别进样测试，根据子离子m/z 86 的峰面积与样品浓度，绘制校准曲线，结果见图3。由图3 可见，在20 ~ 1000 μg/L 范围内，标样浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性方程为Y = 476.87X + 5379.3，R2 =0.9998。将L- 羟脯氨酸逐级稀释，方法最低检出限10 ng/L(S/N=3)，定量限30 ng/L(S/N=10)。在牛奶样品中添加与最低检出限相当浓度的一系列标样，来验证方法的灵敏度，本方法在实际样品中的最低检测限为1.25 mg/kg，定量限为4.2 mg/kg。
重现性及加标回收实验
在纯牛奶样品(羟脯氨酸未检出)中加入羟脯氨酸标样，经样品处理处理后，以选定的方法测定，结果见表1，可以看出，方法的精密度良好(RSD<3%)，加标回收率89 % ~ 94 %，方法准确可靠。
样品分析
分别称取0.2g 某品牌牛奶样品、猪皮胶原蛋白各3 份，检测得到典型图谱见图4，图5。在牛奶样品中未检出L- 羟脯氨酸，说明该牛奶样品中未添加“皮革奶”。猪皮胶原蛋白样品中L- 羟脯氨酸检测含量为14.12 %，结果与胶原蛋白中的羟脯氨酸实际含量一致。
