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原代细胞培养经典案例和细胞药筛介绍（一）

2020.5.18

威斯腾生物经过10多年的发展，获得了上百种细胞株和四十余钟原代细胞培养经验，并建立了庞大的细胞库及原代培养资料库；细胞平台有资深实验员、规范的SOP操作文件，万级净化细胞房，这些条件为保质保量完成每个客户的实验提供了保障。

同时，威斯腾生物结合多年原代及传代细胞培养经验，结合平台已有的技术优势，建立了完善的体外药筛实验，并引进RTCA（Real-time cellular Analysis，实时无标记细胞记录仪），在药筛过程中，全程实时记录细胞真实状况，为药筛提供最真实精准的实验数据。

威斯腾生物与上海中科院生物与细胞所化学生物学技术平台合作，享有英国国家医学研究院科技转化部MRCT独家提供的约1万种核心结构小分子化合物库资源，基于成药性结构设计，特别适于进行以新药研发为目的的活性化合物筛选。精选SiRNA库，包含20个亚库，可根据需求定制提高通路筛选。

原代细胞培养经典案例

1、淋巴细胞的原代培养

淋巴细胞主要来源：脾脏、外周血

分离方法：Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各成分的比重存在差异，因此得以分离。

分离效果：单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。

步骤：

1）眼球取血，将血液滴入肝素抗凝管中，加入PBS按1：1稀释血液（一般采血管2mL+2mL）。

2）取淋巴细胞分离液2mL于15mL灭菌离心管中待用。

3）吸取稀释血液，在离分层液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分层液上，并与分离液形成明显界面。

4）室温，离心2000rpm，20min。此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是淋巴细胞层呈白膜状。

5）小心吸取中间呈白膜状的淋巴细胞层，尽量全部吸出。加5倍以上体积的PBS洗2次，每次离心1500rpm，10min。

6）去上清液，加入1640培养基1mL混匀，取少量进行细胞计数。

7）用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性：活性应在95％以上。

8）接种后培养，条件为37℃、5%CO2、饱和湿度。3d后，每48h添加等体积的新鲜培养基。

淋巴细胞

2、乳鼠心肌细胞的原代培养

原理：

乳鼠心肌细胞属于原代生长细胞。心肌组织中心肌细胞约占50%，非心肌细胞占50%，用酶消化法将心肌组织碎块经纯化分离成单个心肌细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，内心肌细胞可达95%，在体外适宜条件下，使心肌细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。在乳鼠心肌细胞培养实验中能直接观察到培养心肌细胞生命活动的动态过程，还可利用电镜手段、同位素标记、放免法和免疫组化法来研究细胞形态结构及细胞内化学物质的分布。

步骤：

1）新生乳鼠剪开胸，取心尖部位。

2）剔除周围结缔组织，将心脏置于无菌平皿中，将心脏尽量剪碎，平皿内加入适量0.125%的胰酶，在37℃培养箱中，采用分次消化，每次消化5min，一共消化8-10次。
3）每次消化后取上清液，中和胰酶的消化，防止消化过度。用200目过滤筛过滤混合液。离心后收集沉淀，用PBS再次重复离心3次。用细胞培养基将细胞沉淀重悬，接种于细胞培养瓶中培养。

4）培养90min左右，将未贴壁的细胞悬液吸出。此时已经贴壁的是心肌成纤维细胞。

5）将未贴壁的细胞悬液放入新的培养瓶中继续培养，并每日观察心肌细胞的生长。