层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析-1
一、实验目的和内容
目的:1. 掌握凝胶过滤层析的原理,掌握凝胶柱柱效测定方法;
2. 熟悉凝胶层析的一般过程;
3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。
内容:1. Sephadex G-50凝胶柱的装填;
2. 凝胶柱柱效测定;
3.凝胶再生的方法。
二、实验仪器和试剂
1. 实验仪器
层析柱(1×40 cm),砝码天平,玻璃棒,分部收集器,核酸蛋白质检测仪,记录仪,滴头吸管
易生物仪器库:http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物试剂库:http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
2. 实验材料和试剂
Sephadex G-50,0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液,5%丙酮(PBS缓冲液作为溶剂)
三、实验步骤
清洗层析柱
测定层析柱的内径、高度,计算所需凝胶的体积
根据Sephadex G-50的膨胀体积,计算所需干凝胶的质量
称取相应质量的干凝胶,加入其总吸液量10倍的0.02 mol/L PBS
在100℃水浴中加热溶胀1小时以上,溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去
用真空干燥器抽尽凝胶中空气,并将凝胶上面过多的溶液倾出
关闭层析柱出水口,向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液
(重复使用的填料,从此步开始)
边搅拌,边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中,使其自然沉降
等凝胶沉降约2-3cm后,打开柱的出口,调节合适的流速,使凝胶继续沉积
待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱,关闭出水口
通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5~1 mL/min)
始终保护凝胶上端有一段液体