层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析-4
（三）凝胶的选择
根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。 一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的 2 倍，例如 Sephadex G-200 的吸水量为 20 ， 1 克 Sephadex G─200 吸水后形成的凝胶体积约 40mL 。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用 100-200 号筛目的的 Sephadex G-200 效果好； 脱盐用 Sephadex G-25 、 G-50 ，用粗粒，短柱，流速快。
（四）凝胶的制备
商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在
1-2 小时内即可完成。特别是在使用软胶时， 自然膨胀需 24
小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。
（五）样品溶液的处理
样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过 Sephadex G-15 短柱除去。样品的粘度不能太大，否则影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。
（六）防止微生物的污染
交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有：
（1）叠氨钠（ NaN3） 在凝胶层析中只要用 0.02 ％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶于水，在 20 ℃ 时约为 40
%。它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析特性，但可干扰荧光标记蛋白质。
（2）可乐酮 [Cl 3C-C(OH)(CH3)2 ] 在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02 % 。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于 60℃ 时易引起分解而失效。
（3）乙基汞代巯基水杨酸钠 在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为 0.05-0. 01 %。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。
（4）苯基汞代盐 在凝胶层析中使用浓度为 0.001%-0.01 %。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。
除了直接加入抑菌剂，在位消毒 （Sanitization-in-place,
SIP）和在位清（Cleaning-in-place，CIP）对层析介质和仪器的保养十分重要。SIP的目的是将微生物感染减到最低，绝大多数的微生物可用0.5-1M
NaOH以该凝胶的建议流速洗约0.5-1小时消除。CIP的目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。凝胶在使用十次以后，最少做一次CIP。事实上，做CIP
时，往往已经包含了SIP，不必再重复。新一代Bioprocess凝胶由于拥有很高的化学稳定性，大都可用至1-2M
NaOH在位清洗。BioProcess离子交换、疏水层析介质以40cm/h, 用0.5-2M
NaOH相反方向洗四个体积，再以最少3cv平衡缓冲液再生。凝胶过滤介质CIP
的方法相同。但流速需减至20cm/h，接触至少一至二小时。SOURCE介质用二至五个柱体积1M NaCl、1M NaOH、1M HCl、1M
NaCl 的顺序以180cm/h 洗柱。每个溶液间需用二个柱体积蒸馏水过柱。去除脂类及疏水性强的蛋白, 使用递增式梯度以4~10cv
70%乙醇或30%异丙醇洗柱，再用最少3cv蒸馏水加以过柱。或用2cv 0.5% 非离子性去污剂 [溶在1M乙酸中] 洗柱，再用五个柱体积70%
乙醇过过柱，最后用3～4cv蒸馏水加以清洗。
（六）凝胶回收
如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用 70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达 90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。
参考文献
[1] 王璞，林红,朱滨.凝胶过滤层析实验中Sephadex的溶胀与回收保存.实验技术与管理,2006,23 (2):24-25.
