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PCR之歌+PCR十大常用网站+结果图剖析（二）

2021.7.01

9.ResearchGate

网址：https://www.researchgate.net/

该网站有些像研究者们专属的Facebook，方便研究者联系和跟踪同事，上传发表论文同时也可积极参与研究相关主题的讨论。在该网站注册登录后，查看PCR板块就可以询问到与PCR相关的任何问题，最重要的是此网站中对问题的答复都非常迅速，即便你是个完完全全的PCR新手，也能从中获取很多有关PCR操作的建议和讨论。

10.Protocol Online

网址：http://www.protocol-online.org/

这个网址类似于Research gate的Q&A部分，尽管该网站界面看起来有些简单粗糙，但确是一个protocol集中营，可帮助实验菜鸟解决疑难杂症。其中很多内容均是基于用户体验的，且囊括了很多有关实验方面的问题及答案，因而解决问题时应择善从之，符合或最接近自身实验条件的才是最好的实验protocol。

PCR 结果图剖析

辛辛苦苦提完 RNA，逆转录后一个个孔加完引物和模板，最后进行 RT-PCR，你以为这样就可以美滋滋地坐等结果了？等到一幅下面这样的结果图，不知道对于刚接触 RT-PCR 的你来说内心是否是崩溃的？

这是啥？怎么看？

别急，让我慢慢跟你介绍，看完后你就能准确的分析出你的 RT-PCR 结果了。（这里以 7500 软件为例进行介绍）

1. 首先设置好内参和对照组（在 Analysis Settings 处），一般我们在上机前会对应设置好的，如果设置好的话可以直接跳至第 3 点。如果没有设置好的话是需要重新进行设置。

2. 点击进去后，选择对应好的内参和对照组。（在 Relative Quantization Settings 选项下）

3．选择好内参和对照组后，我们首先看看 PCR 跑的有没有问题，在这里大家最常会见到的问题是在样品池出现了三角形符号，如下图：

那么这些三角形代表什么意思？没错，聪明的你应该已经想到是这个孔出现了问题，而三角形中的数字是几则代表了孔中有几个问题。具体又是什么问题呢？我们就要通过 analysis 中的 QC Summery 进行查找。

举个栗子，比如图中的 A9 孔，出现了 2，则表示有 2 个问题，第 1 个问题如上图所示，High standard deviation 高的标准偏差，表示可能是你上样时导至的样品复孔之间差异较大。第二个问题则是下图中，系统认定 A9 孔中的数值偏差较大，属于异常值。

当然，还有比较常见的问题是引物二聚体引起的双重峰，如 A4 孔。

4. 溶解曲线（melt curve）：表示随温度升高 DNA 的双螺旋结构降解程度的曲线。总的 DNA 双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度（Tm），不同序列的 DNA，Tm 值不同。DNA 中 G-C 含量越高，Tm 值越高，成正比关系。正如上面提到的，正常的样品孔溶解曲线应该是单峰的，如下图。如果出现了双峰，则要考虑是否引物设计不合理或者引物过量引起溶解曲线出现多峰的情况。