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重组的果蝇 NAP－1 的表达和纯化实验1

2019.4.11

实验材料	晚对数期的悬浮培养的SFP细胞
试剂、试剂盒	高滴度的 His－NAP－1 杆状病毒储液（Orbigen）磷酸缓冲盐溶液（PBS）裂解缓冲液 H 洗涤缓冲液 H 洗脱缓冲液 H HEGD 缓冲液 NAP－1 纯化缓冲液 Ni－NTA 牛血清白蛋白（BSA）标准乙醇液氮
仪器、耗材	离心机 Wheaton 杜恩斯匀浆器 MWCO 透析管 FPLC装置
实验步骤	1.实验前准备 1.1材料晚对数期的悬浮培养的SFP细胞（＞2×10⁶细胞/ml） 1.2 试剂高滴度的 His－NAP－1 杆状病毒储液（Orbigen）磷酸缓冲盐溶液（PBS），冰冷裂解缓冲液 H 洗涤缓冲液 H 洗脱缓冲液 H：含有 480 mmol/L 咪唑的洗涤缓冲液 H 含有 0.1 mol/L NaCl 的 HEGD 缓冲液含有 0.0、0. 1、1.0 mol/L NaCl 的 NAP－1 纯化缓冲液牛血清白蛋白（BSA）标准，2 mg/ml （Pierce， Cat.No.23209） Source 15Q 树脂（Amersham Pharmac1a B1otech） 20％（V/V）乙醇 8％和 15％ SDS-PAGE 凝胶液氮 1.3 耗材 Ni－NTA 琼脂糖树脂（Qiagen）带有倾斜斗转子的临床离心机，4℃ 适用于临床离心机的 250 ml 圆锥形离心瓶 40 ml Wheaton 杜恩斯匀浆器，A 型研磨棒 Sorvall Superspeed离心机，带有 SS-34 转子（或相当的物品） 15 ml和 50 ml 锥形管直立圆筒旋转混合器 12 000～15 000 MWCO 透析管 HR－5 或 HR－10 FPLC 柱（Amersham Pharmac1a B1otech） FPLC装置硅烷化的 1.5 ml 聚丙烯管子（如 ISC B1oExpress， Cat.＃ C－3302－1） 2. Sf9 细胞在 500 ml 或 1000 ml 旋转式培养瓶中生长至＞2.0×10⁶ 细胞/ml。用培养基稀释至 1.0×10⁶ 细胞/ml。每升细胞培养液使用 25 ml 扩增的 His－ NAP－1 病毒感染。 3. 感染 72 h 后，4℃，在 250 ml 锥形瓶中使用临床离心机 2000 r/min 离心 5 min 收集细胞。用冰冷的 PBS 重悬细胞（0.1 体积的原细胞培养体积）。重复离心。从这一步开始，除非明确指出，在冰上或冷室进行所有的操作，所有的溶液都应为 4℃。细胞沉淀可以在液氮中速冻并在进一步的操作前于 -80℃ 保存几周。 4. 用裂解缓冲液 H（1/40 原细胞培养体积）重悬细胞。在 Wheaton 杜恩斯匀浆器中使用 A型研磨棒在 30 min 时间里匀浆 40 次。4℃，14 500 g （SS－34 转子 11 OOOr/ min）离心 10 min。将所有的上清液集中到一个 50 ml 锥形管中。 5. 每 500 ml 原细胞培养体积取 1 ml Ni－NTA 琼脂糖树脂在裂解缓冲液 H 中平衡。加入细胞抽提物，并在直立圆筒旋转混合器上孵育 3～4 h。使用临床离心机 4℃， 2000 r/min 离心 5 min 收集树脂。用 100 ml 裂解缓冲液 H 洗涤树脂两次，然后用 100 ml 洗涤缓冲液 H 洗涤树脂两次，每次加入缓冲液后，颠倒管子重悬树脂，每次洗涤后，在临床离心机中 2000 r/min 离心 3 min 收集树脂。 6. 用 2 ml 洗脱缓冲液重悬树脂，轻轻振荡以洗脱蛋白质。冰浴 5 min。在临床离心机中 2000 r/min 离心 3 min，将上清液转移到冰上的新的管子中。重复洗脱循环 3 次以上，将洗脱液集中到一起。 7. 将洗脱的 NAP－1 在 12 000～15 000 MWCO 透析管中对 4L 含有 0.1 mol/L NaCl 的 HEGD缓冲液进行透析 2 次，每次 2 h。 8. 对 4L 含有 0.1 mol/L NaCl 的 NAP－1 纯化缓冲液再透析 2 h。 9. 将透析好的溶液转到 15 ml 锥形管中，4℃，14 500 g （SS－34 转子 11 000 r/min）离心去除沉淀。将透析好的 NAP－1 蛋白与 BSA 标准同时进行 SDS-PAGE 电泳分析，以估计蛋白质的数量。 10. 使用 FPLC，根据操作规程将 Source 15Q 树脂装入 HR－5 或 HR－10 柱。每 5 mg 步骤 8 中的 NAP－1 装柱 1 ml 树脂。用 10 倍柱体积的含有 0.1 mol/L NaCl 的 NAP l 纯化缓冲液平衡 Source 15Q 柱。 11. 将 NAP－1 上样到 Source 15Q 柱上。用 10 倍柱体积的含有 0.2 mol/L NaCl 的 NAP－1 纯化缓冲液洗涤样品。用 20 倍柱体积的含有 0.2～0.5 mol/L NaCl 梯度的 NAP－1 纯化缓冲液洗脱蛋白质。早期的峰（低盐）对组装有抑制作用，而晚期的峰（高盐）却可以激活。14 kDa 的条带（见第 8 步）与早期的峰（抑制作用）一起被洗脱出来。收集 0.25～0.5 柱体积的组分。 12. 每个组分各取 2 ul 进行 15％ SDS－PAGE 凝胶电泳以确定含有纯的 NAP－1 的组分。将蛋白峰合并后透析两次，每次对 2L 含有 0.1 mol/ L NaCl 的 NAP－1 纯化缓冲液透析 2 h。 13. 将透析好的 NAP－1 蛋白与 BSA 标准同时进行 8％ SDS－PAGE 电泳分析，确定蛋白质的浓度。将得到的溶液分装于 1.5 ml 硅烷化的管子中，每管 100～200 ul，并用液氮速冻，保存于-80℃。展