细胞中的微丝染色及微丝与细胞形态的实验观察
实验概要
掌握考马斯亮蓝R250 染细胞骨架微丝的方法，了解动物细胞骨架的基本形态结构。
实验原理
真核细胞胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架(cytoskeleton)。根据纤维直径、组成成分和组装结构的不同，分为微管(microtubule, MT)、微丝(microfilament, MF) 和中间纤维(intermediate filament, IF)。微丝是肌动蛋白构成的纤维(F-action)。单根微丝直径约7nm，在光学显微镜下看不到。本实验用考马斯亮蓝R250(Coomassie brilliant blue, R250)显示微丝组成的应力纤维。应力纤维在体外培养的贴壁细胞中尤为发达，形态长而直，常与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长。细胞松弛素B 可与微丝的亚单位肌动蛋白结合，从而破坏微丝，改变细胞的形状。考马斯亮蓝R250 可以染各种蛋白，并非特异染微丝。但在该实验条件下，微管结构不稳定，有些类型的纤维太细，光镜下无法分辨。因此，我们看到的主要是由微丝组成的应力纤维。
主要试剂
1. PBS(pH7 .2)
2. 2%Triton X-100 液
3. M-缓冲液
4. 3%戊二醛固定液
5. 0.2%考马斯亮蓝染液
6. 100μL/mL 的细胞松弛素B
7. DEME 培养液
主要设备
1. 光学显微镜
2. 镊子
3. 小平皿
4. 载片
5. 吸水纸
6. 37℃恒温箱
实验材料
盖片培养的成纤维细胞C6 三片。
实验步骤
1. 成纤维细胞微丝的染色
1) 在平皿中用盖片培养C6 成纤维细胞。
2) 将盖片放入盛有PBS 的平皿内用吸管轻轻吹洗盖片，换液三次，每次3min，洗去培养液。
3) 将盖片移入2%Triton X-100 液，置37℃恒温箱内处理20~30min。M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用。
4) 立刻将盖片移入M-缓冲液，换洗三次，每次3min。
5) 将盖片移入3%戊二醛固定5min。
6) 将盖片移入0.2%考马斯亮蓝染液染液中，染色15min。然后小心的用自来水冲洗，空气干燥。
2. 成纤维细胞微丝对细胞松弛素B 的反应
1) 在平皿中有三张成纤维细胞贴壁生长的盖片，在超净工作台内将一张盖片移入另一平皿中继续培养，用作对照。
2) 在有两片的平皿内加100μL/mL 的细胞松弛素B 4 滴继续培养半h。
3) 将用细胞松弛素B 处理过的两张盖片取一张做染色处理，另一张用培养液洗五次(在平皿内换5 次培养液，每次都要摇动)，继续培养观察。2h 后细胞形态恢复，接近正常。
4) 对恢复的盖片与第一张没用药的盖片一同做染色处理。
注意事项
1. 洗片时要轻柔，以免把细胞从载片上洗去。
2. 恢复时间要足够，否则细胞不会恢复到未处理前的情况。
3. 细胞盖片注意正反面。
4. 染色后应冲洗盖片背面，避免损伤细胞。
