微生物的分离、接种和培养技术
一、实验的目的和内容
目的：掌握微生物接种和分离纯化技术，掌握无菌操作技术。
内容：用平板划线法分离微生物；学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。
二、基本原理
在自然界中，各种微生物是在互为依赖的关系下共同生活的。因此，为了取出特定的微生物进行纯培养，必须从中把他们分离出来。
微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。无菌操作是微生物接种技术的关键。接种是将微生物或微生物悬液引入新鲜培养基的过程。由于实验目的、培养基种类及实验器皿等不同，所用接种方法不尽相同。斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的。
分离培养微生物时，要考虑微生物对外界的物理、化学等因素的影响。即选择该类微生物最适合的培养基和培养条件。在分离、接种、培养过程中，均需严格的无菌操作，防止杂菌侵入，所用的器具必须经过灭菌，接种工具无论使用前后都要经过灭菌，且在无菌室或无菌箱中进行。
三、 材料及器材
（一）菌种：大肠杆菌、枯草杆菌，金黄色葡萄球菌，酵母菌。
（二）培养基：肉汤培养基试管斜面，肉汤半固体培养基，肉汤固体培养基试管斜面，肉汤固体培养基平板，查氏培养基试管斜面，查氏培养基平板。
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（三）仪器及其他工具：接种环，接种针，接种钩，镊子，酒精灯，火柴，酒精棉，试管架，标签纸，恒温培养箱等。
四、方法与步骤
（一）接种。
1、试管菌种转接：
试管细菌菌种转接主要用于菌种的活化、分离、纯化。
（1）将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与其他四指之间，用右手的无名指与小指和手掌边拔出棉塞并挟住。
（2）置试管口于酒精火焰附近。
（3）将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰3次，然后再放入有菌试管中，在管壁上停留片刻待其冷却。
（4）取少许菌种置于另一支试管中，按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。
（5）取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。
（6）重新塞上棉塞。
（7）烧死接种工具上的残余菌，把试管和接种工具放回原处。
（8）在斜面管口写明菌种名称、日期，置37℃恒温培养18—24小时，进行观察。
2、试管菌种接种到平板培养基：
试管细菌菌种转接到平板培养基主要用于菌种的分离、纯化。
（1）左手持试管菌种，右手松动试管棉塞，烧接种工具。
（2）右手小指与手掌边取下棉塞，取菌，打开平皿。
（3）将菌种接种到平皿上，采用平板划线法（分区划线或连续划线），然后立即盖上平皿。
（4）在酒精灯火焰上灼烧接种工具灭菌。
（5）棉塞过火，重新塞入试管。
（6）在平皿底写明菌种名称、日期，倒置于37℃恒温培养18—24小时，进行观察。
3、液体培养基接种
液体培养基接种主要用于微生物的增菌培养。
（1）用灭菌的接种环挑取细菌菌种迅速移到肉汤培养基管，涂于接近液面的倾斜的管壁上，并轻轻研磨，再直立试管，菌种即溶于肉汤中。
（2）灼烧接种环，放回原处。两试管口经火焰灭菌后塞上棉塞。
（3）在斜面管口写明菌种名称、日期，直立于37℃恒温培养24小时，进行观察。
4、半固体培养基接种
半固体培养基接种主要用于检查细菌的运动性。
（1）按试管菌种转接法握持菌种管和半固体培养基管，靠近火焰。
（2）将接种针在火焰上烧灼灭菌，冷却后从菌种管中挑取少许大肠杆菌菌苔，迅速移至肉汤琼脂半固体培养基管中。
（3）将接种针从培养基础中央垂直剌入至管底3/4处，然后原路退出。接种针不能在培养基中左右移动。
（4）试管口经火焰灭菌后，塞上棉塞。灼烧接种针。用同样方法接种一管金黄色葡萄球菌做对照。
（5）在半固体培养基管上写明菌种名称、日期，直立于37℃恒温培养24小时，进行观察。
（二）分离：
分离微生物的方法很多，其目的都是把混杂的微生物分离为单个细胞使其生长繁殖，形成单个菌落，以便得到纯菌种。本实验以平板划线法分离。
1、在无菌条件下，分别取一接种细菌放入盛有无菌水的试管中，制成混合菌液。
2、在近火焰处，左手拿平板稍抬皿盖，右手持接种环蘸取一环混合液伸入皿内划线。
3、将接种分离后的细菌放在37℃的恒温箱内，培养24h后观察。
