临床微生物实验室细菌分离接种技术的研究进展
近年来, 随着现代医学和科学技术的发展, 新的科技成果正不断地被迅速应用于医学科学研究和临床实践。其中, 临床微生物检验技术也得到快速发展, 各种非培养快速诊断方法的建立缩短了检验时间[1, 2]。但作为循证医学的直接证据, 病原菌分离培养仍然是诊断感染性疾病的金标准, 也是进行体外药物敏感性试验、合理选择抗菌药物进行个体化抗感染治疗的主要手段。作为细菌培养和鉴定的前期基础, 微生物标本接种技术得到一定发展, 出现了商品化的自动化、半自动化接种仪。目前在国内临床微生物实验室中, 以接种环手工分区划线接种标本方法为主, 兼有自动化、半自动化标本接种方法共存, 尚难以进行统一操作和标准化。为提高检验质量, 开展有效的标本接种质量控制, 我们就临床微生物实验室细菌分离接种技术的发展现状和研究进展进行综述。
一、目前微生物标本接种的经典方法
利用接种环分区划线以获取单个菌落是经典的细菌接种方法, 目前仍然被国内外临床实验室广泛采用。但该方法也存在一些弊端。首先, 该方法对个人操作水平要求较高, 不仅必须做到无菌操作, 而且要通过严格培训和长期操作实践, 才能获得理想的分离效果; 其次, 人工接种方法总体效率低, 并受操作者个人水平和接种习惯的影响, 主观影响因素较多, 重复性差; 另外, 在整个接种过程中, 标本完全暴露于空气中, 操作者与标本近距离接触, 自身健康受到威胁。总之, 这种经典的细菌接种方法工作效率低, 难以进行标准化和实施质量控制, 无法满足现代化的实验室对自动化、标准化的要求。
二、自动化快速接种技术发展现状
标本接种自动化和标准化是临床微生物实验室提高检验质量、开展质量控制的主要研究和发展的方向之一。19世纪70年代, 美国已经开始了自动化微生物接种仪的研究。1973年, 美国埃德坎贝尔博士与美国食品药品管理局研究员发明了螺旋接种方法自动计算细菌的数量, 并最早于1977年获得螺旋接种仪的发明ZL, 于1979年与Interscience的创始人Fracois/Jalenque共同研发生产了第一代螺旋细菌接种仪, 主要用于食品药品中微生物检验。1992年, 他们重新校正了Spiral螺旋接种方法, 并申请了ZL, 成为第一代接种仪接种原理的理论基础。
迄今, 自动化接种仪研究方兴未艾, 自动化快速接种技术仍然不够成熟。目前, 仅有少数几种自动或半自动化微生物接种仪投放市场, 而且多数仍处于逐步完善阶段, 甚至是临床试验阶段。因此, 配备自动化微生物接种仪的国内临床微生物实验室还很少; 国际范围内, 也仅有很少大型的临床实验室配备全自动细菌分离培养系统。按照接种原理分类, 现有自动化接种仪均采用划线接种的原理, 能够实现半定量接种, 仍然归属为第一代产品。与日趋成熟的微生物自动化鉴定技术相比较, 第一代接种仪在接种技术的诸多方面还很不成熟, 有一些技术问题尚待解决[3]。
在第一代接种仪中, 以意大利Diesse公司生产的Robobact system全自动微生物分离培养系统、法国Interscience公司研制的 EasySpiral Pro全自动螺旋接种仪以及法国生物梅里埃公司推出的PREVI Isola自动化微生物接种仪最具代表性。
Robobact system全自动微生物分离培养系统将标本接种与平板孵育集成到一台仪器, 使用方便。采用特制的平板和简单划线接种技术, 平板面积小, 无分区划线设计, 可以用于粪便、拭子、尿液标本中病原菌的分离培养[4], 但不适合下呼吸道标本, 因这类标本可能含有大量正常菌群而又需要分离培养其中的苛养菌[5], 不宜全部采用选择性培养基, 无分区接种难以达到分离效果。
EasySpiral Pro全自动螺旋接种仪实现标本自动加样、自动接种、自动清洗、消毒接种针等过程, 其中自动接种过程仅需25 s, 除了进行细菌分离培养, 还能够用于药物敏感性试验[6, 7]。但在涂布平板进行药物敏感性试验时, 有时会将琼脂整个卷起; 为防止交叉污染, 每份标本接种后都必须进行清洗、消毒接种针, 由于部分细菌对消毒剂耐药或形成芽胞, 25 s内彻底杀灭所有细菌理论上是不可能的[8, 9]; 而且, 高浓度消毒剂未必就能达到理想的杀菌效果, 接种针还可能携带残余消毒剂; 由于该仪器为单臂型(一个接种通道), 每个工作循环(包括标本更换、平板更换、吸样、接种、清洗消毒)只能处理1份标本, 仅接种1块平板; 需要清洗、消毒和人工填充平板, 自动化操作过程难以连续进行; 特别是在操作过程中, 为防止交叉污染, 实际需要清洗和消毒接种针次数多、时间长[9], 工作效率不高, 不适于大批量标本接种。这些因素可能是造成该仪器目前难以在临床微生物实验室大量推广应用的主要原因。
PREVI Isola自动化微生物接种仪是目前被认为自动化程度最高、接种效率最高、技术最成熟的接种仪。具有自动平板填充功能, 可选择平板、贴标签并记录平板类型和接种时间等[10, 11, 12]; 可精确吸取标本, 并使用接种涂布器分离接种, 重复性很好, 交叉污染率较低[13]; 与手工法比较, 平板有效利用率高, 分离到单个菌落多[14]; 但该接种仪不能进行自动化标本杯开盖、关盖, 出现卡板现象可导致死机; 同批次接种不同类型标本时, 接种效率低; 不适合接种导管、组织等[13]; 接种涂布器无法将精确吸取的标本全部接种到平板, 因此事实上该仪器仍然只能做到半定量接种。PREVI Isola自动化微生物接种仪还存在一个严重设计缺陷:由17个接种环并排构成的接种涂布器呈一个平面, 必须和同样呈平面的平板表面完美结合, 否则二者难以充分接触, 不仅平板有效利用率下降使分离有效性下降, 而且可能导致接种失败, 得出假阴性培养结果。事实上, 批量生产的含琼脂平板其表面难以完全做到真正水平。美国食品药品管理局于 2012年12月发出通知, 在全球范围召回PREVI Isola自动化微生物接种仪[15]。另外, 接种仪自身制造成本较高, 市场销售价格昂贵; 每接种1份标本均需要更换价格不菲(20~30元人民币)的接种涂布器, 造成使用成本增加; 相对于菲薄的微生物检验利润、昂贵的仪器价格和较高的使用成本, 使其难以在包括我国在内的广大发展中国家推广。
有研究发现, 现有自动化接种仪均缺乏有效的自动标本均质化预处理功能。而标本均质化效果是影响微生物检验质量的关键程序, 也是实现标本接种全程自动化程序中的关键技术。现有自动化接种仪仍采用人工打开标本盖、加入处理液进行均质化处理的传统方法[13], 不仅延误标本接种时间、降低接种过程自动化程度、增加标本污染机会, 而且存在实验室生物安全隐患。
我国开展自动化微生物接种技术研究的时间较短, 特别是研究成果的转化速度相对滞后, 总体研发水平低于国际同行。国内学者魏志勇等[16]研制发明了自动化微生物接种仪, 并获得国家发明ZL。与现今流行的螺旋接种仪不同, 魏志勇发明的微生物自动接种仪仍然采用划线接种原理, 属于第一代自动化接种仪。但与前述其他第一代接种仪不同, 该仪器模拟手工接种, 采用分区划线的方法, 有利于提高病原菌的分离效果; 同时, 该仪器采用红外线加热消毒的方法进行接种环灭菌, 使接种环的灭菌效果更可靠, 较早期第一代自动化接种仪有一定的先进性。但目前尚未见其相应仪器面世, 实验数据不详, 特别是接种速度和接种效果尚未见报道。
三、细菌分离培养技术的发展趋势
2001年我国卫生部颁发了《医院感染诊断标准(试行)》, 其中临床实验室分离病原菌临床意义的判定标准已经具体量化到“ cfu/mL” [17], 与《临床微生物学操作指南》等国际诊断标准的要求是基本一致的[5]。因此, 细菌定量检验, 尤其是条件致病菌定量检验, 对正确诊断和合理治疗临床最常见的由条件致病菌所引起的临床感染(90%以上)[18], 具有非常重要的指导意义。
现有细菌培养检验技术是基于对细菌进行定性或半定量检验, 重复性差, 难以进行标准化。临床微生物实验室仅能对尿液标本、导管进行菌落计数, 对来自下呼吸道的标本做粗略的半定量检验[8], 其他标本不做定量检验[5, 8], 已不能满足临床诊断和治疗的需要; 基于定性或粗略半定量检验, 实验室分离菌株的临床意义(特别是呼吸道标本中的条件致病菌, 如念珠菌属、不动杆菌属和铜绿假单胞菌等)及细菌培养检验报告的临床诊断价值已经愈来愈受到临床医师的质疑。因此, 细菌培养的定量检验已经成为临床实验室迫切需要解决的技术难题, 已经受到包括检验界专家在内的国内外学者的广泛关注。然而迄今为止, 国际上尚缺乏操作简便、快捷, 可用于多种标本进行细菌培养准确定量检验的方法。因此, 开展临床微生物检验标本准确定量检验分析, 建立细菌培养定量检验方法, 将成为临床细菌分离培养技术未来新的发展趋势。
四、自动化微生物接种技术研究进展与前期探讨
准确的标本定量接种技术是建立细菌培养定量检验方法的基础; 而标本接种自动化是微生物检验全程自动化不可或缺的关键技术。因此, 细菌培养定量检验方法的建立应当基于先进的标本自动化接种技术。由于国际上尚没有比较理想的自动化接种仪, 特别是能够准确定量接种的自动化仪器, 缺乏先进的研究平台, 使细菌培养定量检验技术相关研究进展缓慢。目前, 包括法国生物梅里埃公司、法国Interscience公司等国际知名微生物检验仪器和试剂生产商, 仍然在致力于自动化接种技术的科研攻关。
国内王敬华等[3, 19]新近发明了一种多通道自动化微生物接种仪, 探讨了解决微生物标本准确定量接种的问题, 该研究创新了接种原理, 彻底摒弃接种环和划线接种方法。利用伯努利原理(同一流质内, 流体流速与压力呈反比, 即流速大, 压强小; 流速小, 压强大)进行接种, 因而不存在接种环污染、消毒剂携带、频繁更换涂布器或涂布器与平板接触不良等第一代接种仪所面临的技术难题[5]; 而且该仪器不配备自动化平板填充系统, 而是通过采用连通器原理, 设计多通道接种仪, 与单通道的第一代接种仪相比, 10个接种通道同步工作, 有望提高接种仪的实际接种效率; 通过特殊设计, 标本杯已经具备自动化标本均质化预处理功能, 可以节省标本预处理时间30 min以上, 且均质化的液化标本与标本残渣自动分离, 保证标本均质化效果, 为标本的准确定量接种奠定了基础。实验证明, 在压强恒定条件下, 单位时间内密闭容器内液体通过相同孔径导管的流度相同。基于流体力学特性, 结合伯努利原理, 作为定量接种的理论基础, 该方法有望成为自动化标本的准确定量接种方法。前期实验表明, 采用该接种方法所获得的分离接种效果明显优于第一代接种仪。
总之, 与自动化微生物鉴定仪比较, 微生物自动化接种技术还很不成熟, 在一定程度上迟滞全自动微生物检验流水线研发过程。微生物接种自动化研究方兴未艾, 目前尚缺乏能够自动化准确定量接种的检验技术。开展细菌定量检验和分析是临床诊断和治疗的迫切需求, 也是临床微生物检验领域研究值得密切关注的课题之一。加快研制和开发具有我国完全自主知识产权的自动化接种仪, 建立细菌培养定量检验方法, 不仅具有非常重要的临床应用价值和科学研究价值, 而且具有重要的社会意义和经济价值。
