细胞需要促贴壁的条件与操作指南
上次我们已经浅论过细胞不贴壁的原因
今天我们来深扒细胞贴壁具体与哪些物质有关？
那么如何促进细胞贴壁？
许多细胞必须添加促贴壁物质才能贴壁生长，
促贴壁物质一般为细胞外基质，
如纤连蛋白、层粘连蛋白等。
不同细胞外基质对细胞粘附的效果一样吗？
细胞外基质的包被浓度是什么标准？
今天我们就来扒一扒
那些常见的促贴壁物质和包被方法~
大部分来自实体组织器官的细胞都会贴壁，但不是所有的细胞在体外培养的情况下都会贴壁。
密度大于培养基的细胞（绝大部分细胞）通过重力作用会沉降在底面上，这是种自然属性，那么细胞要生存必定得改善这个环境，也是贴壁的主要原因-分泌细胞外基质和黏附因子（Extracellular matrix& Cell Adhesion Molecules，ECM&CAM），改善底面的结构，然后很自然就贴附在底面上了。
细胞粘附分子：是众多介导细胞间或细胞与细胞之间相互接触和结合分子的统称。
细胞外基质：是由动物细胞合并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子。
二者大多数均为糖蛋白，因此具有较强的亲水性——因此能不能贴壁不仅仅关乎细胞是否有这种能力，也与有无合适的底物（培养瓶）有关。
大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的底物而生长，在体外时这些底物可以是其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。
贴壁的过程：细胞首先分泌细胞外基质，这种细胞外基质黏附在支持物的表面（培养瓶，培养皿的底面）。然后，细胞通过其表面表达的黏附因子与这些细胞外基质结合。
▲ 贴壁原理图
一些特殊的促细胞附着物质（如层粘连蛋白、纤维连接蛋白、Ⅲ型胶原、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程。这些促细胞附着因子均为蛋白质，存在于培养液尤其是血清中。在培养过程中，这些带阳电荷的促贴附因子先吸附于底物上，悬浮的圆形细胞再与已吸附的有促贴附物质的底物附着，之后细胞将伸展成其原来的形态。所以细胞贴壁与否和细胞本身分泌细胞外基质的能力以及细胞本身表达的黏附分子的数量有关，也与培养皿壁的表面结构有关。
因此我们可以着手于这些促细胞附着物质，对症下药。
胶原蛋白（Collagen）
是支持细胞和组织生长的重要胞外基质蛋白，其形成的胞外环境有利于多种细胞的黏附、生长、迁移和分化。胶原主要包括I型胶原，Ⅱ型胶原，Ⅲ型胶原，Ⅳ型胶原，Ⅴ型胶原，Ⅵ型胶原几种。
I型胶原——最常见的胶原蛋白，促进细胞的贴壁和增殖，用于内皮细胞，肝细胞，肌细胞等的培养。
软骨细胞对II型胶原的黏附性较好；上皮细胞在Ⅳ型胶原底物上贴壁良好，而在I、II、III型胶原底物的培养板上贴壁情况较差。
胶原应用及建议细胞基质浓度：
纤维粘连蛋白（Fibronectin，FN）
一种位于细胞表面和血浆中的大分子蛋白质，是一种主要的细胞黏附分子，在细胞纤维基质中发挥结构和黏附性作用。
建议以1-5ug/cm²或者 0.5-50ug/ml的浓度作为细胞基质，但最佳浓度取决于细胞类型或研究目的、应用方向。
BI也提供Fibronectin solution（货号: 03-090-1），可参考如下方法包被：
19ml无菌的PBS加1ml的纤连蛋白 (浓度50ug/ml)；
之后一个T25 (表面积25cm²)需用2.5ml包被, 所以视使用情形分装包被；
一个T25加2.5ml纤维粘连蛋白溶液；
放4度至少30分钟；
吸出纤维粘连蛋白溶液；
用无菌的PBS润洗一次, 即可培养细胞。
层粘连蛋白（Laminin）
是细胞外基质的重要组成，存在于所有上皮细胞和内皮细胞的基底侧，同时也是某些细胞与细胞间交互作用的中间媒介。层粘连蛋白有细胞及组织特异性，对于调节细胞功能具有重要作用，如：协助粘附、促进生长、引导迁移、调控分化、维持表型、防止细胞凋亡等。
在哺乳动物胚胎中，Laminin 521和511是最早表达的胞外蛋白，在2-4细胞期，已经可以检测到。LN111支持hPSCs高效，符合GMP标准地分化为均一的多巴胺（DA）前体细胞。相比拟胚体（EB）为基础的实验方案，DA前体细胞的产量在LN111上增加40倍以上。
层粘连蛋白，根据不同细胞系，包被浓度一般为5-20ug/ml。
BioLamina人类重组层粘连蛋白：
化学成分限定，无异源动物成分。
使用1×DPBS(Ca2+/Mg2+)稀释，并将包被溶液加入到培养皿中，确保包被溶液覆盖整个培养皿表面，2-8℃孵育过夜或37℃孵育2小时。
玻连蛋白（Vitronectin）
属于小分子蛋白，借由Vitronectin 受体让细胞贴附于细胞基质中，主要促进细胞迁移，增加细胞贴附性、细胞分裂、细胞生长分化等，并协助细胞间的讯号传递。
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MSC促贴壁试剂是Biological Industries产品，搭配MSC NutriStem XF Medium使用，效果更佳。MSC促贴壁试剂针对多种来源的hMSC（骨髓，脂肪组织和脐带）特别开发。
特点：
• 无异源体系
• 适用于多种来源的MSC细胞贴壁
• 即用型，100倍浓缩液
• 适用于无血清体系
• 适用hMSC增殖和诱导分化试剂
可参考如下包被方法：
1.使用DPBS溶液，将MSC贴壁试剂稀释100倍（1:100）。
2.加入适量的1XMSC贴壁试剂涂层培养皿或板；包被期间， 注意包被液不可以干掉！
3.轻轻摇动培养皿，确认贴壁试剂均匀分布于培养皿表面后，用封口膜包裹涂层的培养皿。
4.在2-8℃孵育过夜；或者在CO₂培养箱，37℃，至少孵育30分钟。
5.接种前, 吸除贴壁试剂，再用DPBS轻轻冲洗培养皿，即可接种细胞。
