蜂产品中蛋白质测定方法的改进
蜂产品中蛋白质的测定主要采用凯氏定氮法,其测定结果稳定可靠,被广泛采用。但其操作较繁杂,消化时间长,需 蒸馏滴定,费时费力。本法通过改进消化条件,即采用过氧化氢2浓硫酸混合液为消化液,消化过程中滴加硝酸2高氯酸混合酸,缩短了消化时间。样品中的蛋白质 与硫酸和催化剂一同加热分解,生成的氨与硫酸反应生成硫酸铵,硫酸铵在碱性溶液中与次氯酸盐生成一氯胺,在亚硝基铁氰化钠催化作用下与水杨酸生成蓝色化合 物,可在655 nm 波长下比色定量。
1 试验部分
1. 1 仪器与试剂
定氮仪；可见分光光度计。显色剂:称取水杨酸5. 0 g ,加入水20 mL ,加入2 mol ·L - 1 氢氧化钠溶液16 mL ,凯氏定氮仪；搅 拌使之完全溶解,再取5. 0 g 酒石酸钾钠溶于少量水中,将上述溶液合并移入100 mL 容量瓶中,用水稀释。次氯酸钠溶液:取经标定的次氯酸钠溶液用氢氧化钠溶液稀释成含有效氯的质量浓度为3. 5 g ·L - 1 ,游离碱浓度为0. 75 mol ·L - 1 (以氢氧化钠计) 。亚硝基铁氰化钠溶液:称取亚硝基铁氰化钠(硝普钠) 1. 0 g ,溶于少量纯水中,并稀释至100 mL ,质量浓度10 g ·L - 1 。氨氮标准溶液: 临用时稀释成质量浓度为1. 0 mg ·L - 1氨氮的标准工作溶液。试剂均为分析纯,水为无氨去离子水。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 样品处理
称取样品2. 0 g 于250 mL 定氮瓶中,加入硫酸铜0. 5 g ,硫酸钾5. 0 g ,硫酸2过氧化氢(2 + 1) 混合液20 mL ;摇匀后于瓶口放一小漏斗,置于有石棉网的可调电炉上,小火加热,至泡沫停止后,加大火力,缓慢分次滴加硝酸2高氯酸(4 + 1) 混合酸2～3 mL ,样液变蓝透明后,继续加热30 min ,取下放冷后,加水20 mL ,冷却后分次洗入500 mL (蜂蜜消化液洗入250 mL) 容量瓶中。移取样品消化液5. 0 mL 于另一个100 mL 容量瓶中,加水至刻度备用,同时作试剂空白。
1. 2. 2 样品分析
移取样品溶液与试剂空白液2. 0～5. 0 mL ,1. 0 mg ·L - 1 氨氮标准工作溶液0 , 0. 50 , 1. 00 ,2. 00 ,4. 00 ,6. 00 ,8. 00 mL 分别于10 mL 具塞比色管中,往样品管、试剂空白管及标准管中加显色剂1. 0 mL ,10 g ·L - 1 亚硝基铁氰化钠溶液0. 2 mL ,3. 5 g ·L - 1 次氯酸钠溶液0. 2 mL ,用水稀至刻度,混匀,静置60 min 后,于655 nm 波长处,用1. 0 cm比色皿,测定其吸光度,绘制标准曲线,计算样品溶液中蛋白质的含量。
2 结果与讨论
2. 1 工作曲线
按试验方法对标准系列溶液进行测定,氮的质量浓度在0～0. 8 mg ·L - 1 范围内呈线性关系,对试剂空白测定20 次,其3 倍的标准偏差为检出限,其检出限为0. 014 mg ·kg - 1 。
2. 2 精密度试验
取蜂王浆、花粉、蜂蜜样品,按试验方法进行6次测定,样品测定值的相对标准偏差(RSD) 结果见表1 。
2. 3 水杨酸法与凯氏定氮蒸馏法测定结果比较
随机抽取了8 份峰产品样品,分别用水杨酸法和凯氏定氮蒸馏法对样品中蛋白质进行测定,测得结果经t检验, t = 0 . 153 ,查t值表, t0. 05 (7) = 2 . 356 ,
所以P > 0. 05 ,两方法测定蜂产品中蛋白质无显著性差异。结果见表2 。
2. 4 回收率试验
取蜂王浆、花粉、蜂密样品,加入氨氮标准溶液,按试验方法进行样品处理与测定,回收率测定结果见表3 。
通过改进蜂产品蛋白质消化的条件,有效地缩短了反应时间,由原来的3. 5 h 缩至2 h 左右。由于水杨酸光度法样品消化液不需要蒸馏,直接用于测定,更适宜于批量样品的测定,水杨酸光度法与国标法比较无显著性差异,所以水杨酸光度法因其操作 简便、准确、迅速,可用于蜂产品中蛋白质的测定。
