实验步骤 |
材料
缓冲液与溶液 贮存溶液、缓冲液与试剂的成分见附录 1。将贮存液稀释成适当浓度。
脂染试剂
NaCl(5mol/L)(选用) 用于稀释 DOGA。
枸橼酸钠(pH5.5,20 mmol/L) 含 150 mmol/LNaCl(选用) DOGS 用作脂染试剂时,可用于代替灭菌水稀释质粒 DNA(Kichler et al.1998)。
核酸与寡核苷酸
质粒 DNA 如果是第一次用脂染或使用不熟悉的细胞系,应使用编码大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶或者绿色荧光蛋白的表达质粒(见第
17 章信息栏中的绿色荧光蛋白)。这些质粒可从几个生产商处购买(如,pCMV-SPORT-β-gal,Life Technologies
公司,pEGFP-F,CLOTECH 公司;见图 16-2,16-3)。
纯化闭环质粒 DNA 可用层析柱或按照第 1 章介绍的溴化乙锭-CsCl 梯度离心。 DNA 用水溶至 1ug/ul。
培养基
细胞生长培养基 [完全培养基,无血清培养基与(备选的)选择性培养基]
特殊设备
试管,聚苯乙烯或聚丙烯试管 DGTMA 会与聚丙烯发生非特异性结合,必须使用聚苯乙烯试管。
组织培养皿(60 mm) 本方法是按照使用 60 mm 细胞培养皿设计的,如果使用多孔平板、细胞瓶、或者不同直径的平皿,则应按比例改变细胞密度与试刑用量。见表 16-3。
附加试剂
本方法步骤 9 可能需要第 17 章方案 7 所列试剂。
细胞与组织
指数生长的哺乳动物细胞培养物
方法
1. 脂染前 24 h, 通过胰酶消化收集细胞,以 105 细胞/平皿的密度平铺细胞于 60 mm 组织培养皿上(或 5X104 细胞/35 mm 平皿)。加 5 ml 生长培养基(用 35 mm 平皿则加 3 ml),于含 5%~7%CO2 的 37°C 温箱孵育 20~24 h。 转染时细胞应 75% 长满。如果转染前细胞生长不足 12 h, 细胞就不能很好地吸附在培养皿上,与脂类接触时易于脱落。
2.
用 100ul 灭菌去离子水(使用 Lipofectin 时)或含 150 mmol/LNaCl 的 20 mmol/L
枸橼酸钠(pH5.5)(使用 Transfectam 时)于聚苯乙烯或聚丙烯试管内稀释 1~10ug 质粒
DNA。在另一个试管内用灭菌去离子水或 300 mmol/LNaCl 将 2~50ul 脂溶液稀释至 100ul。 重要事项:用 Lipofectin 转染时,由于阳离子脂类 DOTMA 会与聚丙烯发生非待异性结合,故使用聚苯乙烯试管,不要用聚丙烯试管。至于其他阳离子脂类,根据生产商的推荐选择试管。
3. 室温下孵育 10 min。
4. 将脂溶液加入 DNA 中,用吸管吹打几次混匀,室溫下孵育 10 min。
5. 孵育 DNA-脂溶液时,用无血清培养基将要转染的细胞洗涤 3 次,然后于每一 60 mm 平皿中加入 0.5 ml 无血清培养基,将细胞再放入含 5%~7%CO2 的 37°C 温箱中孵育。 在加 DNA-脂溶液前,用无血淸培养基洗涤要转染的细胞非常重要有时候,血清会强力抑制转染(Felgner and Holm 1989),同样,胞外基质复合物,如硫酸蛋白聚糖也会抑制转染,可能是通过结合 DNA-脂类而阻止受体细胞质膜与其发生相互作用。
6.DNA-脂溶液孵育 10min 后,于每一管内加入 900ul 无血清培养基。用吸管吹打几次混匀,室温下孵育 10 min。
7. 转移各管 DNA-脂溶液至 60 mm 平皿的细胞中,于含 5%~7%CO2 的 37°C 温箱中孵育 1~24 h。
8. 细胞在 DNA 中孵育适当时间后,用无血清培养基洗涤 3 次,加入完全培养基解育。
9. 如果是稳定转染细胞,继续进行步骤 10。脂染 24~96 h 后用下述方法之一检査细胞。
• 如果使用表达β-葡萄糖醛酸酶的质粒 DNA, 按照第 17 章方案 7 所述步骤检测细胞裂解液中酶的活性,或者依照附加方案:单层细胞组化染色鉴定β-葡萄糖醛酸酶所述通过组化染色检测。
• 如果使用表达绿色荧光蛋白的质粒 DNA, 在 450~490nm 光下用显微镜检査细胞。
• 如果使用其他基因产物为标志,可以通过体内代谢标志进行放射免疫、免疫印溃、免疫沉淀,或者分析细胞提取物中酶活性等方法分析新合成的蛋白。 为减小不同培养血之间转染效率的差异,最好 (1). 用每一构建体转染数个培养皿;(2). 孵育 24 h 后用胰酶消化细胞;(3). 将细胞汇集起来;以及 (4). 重铺细胞于几个培养皿上。
10.
分离稳定转染体:细胞在完全培养基中孵育 48~72 h 后,用胰酶消化细胞并用合适的选择培养基重铺细胞。每 2~4 天更换培养基,持续培养
2~3 周,目的是清除死细胞残骸,促进抗性细胞生长。这样,独立克隆便可以克隆、繁殖,以用于检测 (方法见 Jakoby and Pastan
1979 或 Spector et al.1998b[《细胞实验手册》的第 86 章])。 用预冷的甲醇固定细胞 l5 min. 然后室温下用 10%Giemsa 染色 15 min, 流水冲洗,这样可以纪录细胞克隆数目。Giemsa 染液应是使用前用磷酸盐缓冲液或水新制备的,用 Whatman1 号滤纸过滤。
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