PCR实验操作常见问题及解决方法（二）
二、Generacer
如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（GSP）？
使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点要求：
*50-70％的GC含量，以提高引物熔点（Tm）
*23-28个碱基长度，以提高引物特异性
*降低3’端GC含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低
2. 为什么得不到RACE产物？
*加入Hela对照
*低质量的RNA模板
*逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成
*目的基因丰度太低，可以通过提高PCR的循环次数来解决，建议使用巢式PCR
*目的基因没有表达，可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因
*目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用GeneRacer试剂盒中的Oligo dT来得到全长cDNA，使用随机引物或与模板的5’端尽可能近的GSP进行PCR。
*cDNA模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化PCR反应参数及反应体系；降低退火温度；使用5-10％的DMSO帮助通过高GC含量区；使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。
3. RACE的PCR结果有杂带
RACE PCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因：
*GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。
*GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。
*RNA降解。
*PCR管或试剂污染。
注意：杂带一般是因为没有优化PCR条件，可以加入阴性对照来确定。
4. 得不到全长的5’RACE PCR产物
*CIP反应后的RNA降解产生了新的带有5’磷酸的断裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo连接。一定要小心操作，保证RNA无降解。
*CIP脱磷酸不完全，可以增加反应中CIP的量或减少RNA的量。
*PCR产生了杂带，并不是真正的连接产物，可以使用上述建议优化PCR。
二、Generacer
如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（GSP）？
使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点要求：
*50-70％的GC含量，以提高引物熔点（Tm）
*23-28个碱基长度，以提高引物特异性
*降低3’端GC含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低
2. 为什么得不到RACE产物？
*加入Hela对照
*低质量的RNA模板
*逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成
*目的基因丰度太低，可以通过提高PCR的循环次数来解决，建议使用巢式PCR
*目的基因没有表达，可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因
*目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用GeneRacer试剂盒中的Oligo dT来得到全长cDNA，使用随机引物或与模板的5’端尽可能近的GSP进行PCR。
*cDNA模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化PCR反应参数及反应体系；降低退火温度；使用5-10％的DMSO帮助通过高GC含量区；使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。
3. RACE的PCR结果有杂带
RACE PCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因：
*GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。
*GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。
*RNA降解。
*PCR管或试剂污染。
注意：杂带一般是因为没有优化PCR条件，可以加入阴性对照来确定。
4. 得不到全长的5’RACE PCR产物
*CIP反应后的RNA降解产生了新的带有5’磷酸的断裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo连接。一定要小心操作，保证RNA无降解。
*CIP脱磷酸不完全，可以增加反应中CIP的量或减少RNA的量。
*PCR产生了杂带，并不是真正的连接产物，可以使用上述建议优化PCR。
三、PCR
在进行PCR时：
*请确保您没有使用过量的起始DNA或者过高浓度的引物，也没有加入过量的Mg++
*请确保您使用了恰当的退火温度
*请确保您没有使用过量的DNA聚合酶
四、引物
应该选择哪种纯化方法？
取决于实验目的和引物的长度
2. 为什么我订购了50nmol，但是收到却只有40nmol？
50nmol是起始量
3. 怎样制备100μM的储液？
体积（μl）=质检报告上的nmol数目×10
4. 怎样设计引物？
*一般长度20-30bp；
*至少50%的GC含量；
*避免引物二聚体和二级结构；
*引物对的Tm值应该接近。
5. 引物序列有插入或缺失？
*使用上游和下游引物多测几个克隆。
*请选择正确的纯化方法。
6. PCR无结果？
*请检查引物设计是否正确；
*请检测OD读数是否正确；
*做一个阳性对照和一个阴性对照
