逆转录RT-PCR实验操作程序及注意事项
实验操作过程中必须带口罩、手套，实验室尽量避免人员干扰。
RT-PCR的试剂都应在冰上融化，等完全融化后再取；用过的试剂应瞬间离心后放回-20℃保存；试剂应按顺序加，加完后再混匀离心。
加入试剂前在管壁上做好标记，避免加错试剂；加过一种试剂后将EP管盖子的方向改变，避免重复和漏加；不同试剂和样品要更换吸嘴，避免污染；吸取试剂和样品前检查移液器的标数是否正确，核对正确后再取，避免浪费试剂。
反应体系放入PCR仪前应检查荧光定量PCR仪的反应程序或设计新的反应程序，做PCR时循环参数应根据反应体系来定。
逆转录完成后，产物要加灭菌去了离子水稀释后再做PCR。这一步容易遗忘，不但导致结果异常，还浪费RT产物及其他试剂。
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物是非常重要的，内参的上样量应减半。制胶时要保证上样孔完整，上样时样品孔中不能有气泡，如果有气泡应用移液器反复吹打将气泡赶走；上样时样品不能漏也不能溢，如果上样时枪头插得太深刺破上样孔底部就会使DNA样漏掉，造成假阴性，使结果不准确。如果上样孔容积太小或上样量太多都会使DNA样溢出，造成条带相融合无法比较。只有电泳条带整齐才能保证结果的准确性。在配制琼脂糖凝胶时要加终浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭（EB）对DNA片段染色。EB染色效果好，但是Ames实验证明，EB是致突剂和可疑致癌物，在使用过程中要带口罩、手套，不要直接接触EB。RT-PCR技术应用广泛，是分子生物学实验中的常用技术，用此方法可利用从哺乳动物细胞中提取的1——2条mRNA建立大量的cDNA文库。此外临床上可用RT-PCR检出病人标本中的引起疾病的RNA病毒，如HAV、HCR、HOV等。操作上的任意一个小失误都可能导致实验失败，特别是如果浪费了cDNA的话，又要重新提取RNA，甚至重新培养细胞，会使整个实验的周期延长，而且实验试剂和耗材都很昂贵。无论从时间、经济以及精力上都是很大的浪费。熟练掌握此项技术，提高实验的准确率对从事分子生物学研究和临床检验的工作人员是非常重要的。
