超分辨率显微镜实现自由运动神经环路高分辨成像
提到在体小动物神经成像，人们自然会联想到钙离子荧光探针局部注射或遗传钙指示剂（如Gcamp家族）结合双/三光子显微镜的经典在体成像组合。
随着基因改造技术的突飞猛进，通过病毒转染和转基因技术，在神经元内源性表达“基因编码类钙指示剂（genetically encoded calcium indicator, 简称GECI）”成为神经元钙成像的大趋势。这种由神经元自身产生钙指示剂的方法与之前的钙染料技术相比有着巨大的优势: 信噪比提升了一个数量级；对神经元特异性好，可以区分不同的神经元类型；并且可以在大脑神经元内持续表达数月（病毒转染）甚至整个生命历程（转基因动物）。另一方面双光子成像本身具有高分辨率、高通量(高速)、非侵入、成像深度大等特点，与荧光蛋白以及荧光染料等标记物在细胞中的定位与表达技术相结合，能够在生命体和细胞仍具有活性的状态下对其功能进行动态观察，使得人们可以研究处于生理状态时的动物大脑内的神经元活动。
大概10年前开始，科学家就开始利用双光子成像结合 GECI 技术对神经元的活动和结构变化进行长期的观测和追踪，从而对记忆的形成，神经元病变等问题有了更深入的认识。其中，现在性能最好，使用最为广泛的 GECI 为绿色荧光钙调蛋白 Gcamp 家族。目前已经改进到第六代，Gcamp6f，Gcamp6f 已经成为神经成像里最受欢迎的指示剂之一。目前科学家最流行的对小动物行为过程中大脑活动进行成像的方法，是将虚拟现实与双光子成像相结合，在动物头部被固定的情况下，在其眼前制造影像，让动物认为自己处在”真实“的环境之中。通过小鼠四肢在类似跑步机或者鼠标滚球上的运动来模拟其真实活动。以求达到研究神经元在动物行为中所起到的作用（如图1）。
图1 双光子成像结合虚拟现实场景，对头部固定，身体活动的动物进行研究。图片来自1
然而，这种虚拟现实加头部固定成像的方法，已经遭到许多科学家的质疑。人们认为，头部固定的动物在实验期间一直处在物理约束和情绪压力下，因此无法证明神经元对外界的响应在虚拟现实和自由探索下是等价的。更重要的是，许多社会行为，比如亲子护理，交配和战斗，都不能用头部固定的实验来研究。如何在动物自由活动的时候，直接对其神经元进行成像，是神经科学家还未能得到解决终极的诉求。
一个理想的解决方案是开发微型荧光显微镜直接固定在自由活动的动物身上，让动物“带着显微镜跑”2。起初，科学家只是将一根或几根光纤插到小鼠头上，用以激光导入和荧光信号采集。然而，这种方式而只是记录某个区域内信号的总和，不具有空间分辨率，算不上真正意义上的成像。在最近的十几年里，由于光学，电子，材料技术的发展，人们开始尝试研制真正意义上的微型显微镜。其中，微型单光子宽场显微镜（miniature wide-field microscope），由于其原理与结构相对简单，是目前人们主要尝试研制的微型显微镜技术。例如由Ghosh及其同事开发的显微镜，通过将小型 LED 光源，微型 CCD 和自聚焦透镜整合到一个小于1cm3的框架之中，研制出了一个重量为1.9g 的微型宽场显微镜。该技术被用于研究大脑海马区 place cell 等与记忆和本能相关的实验当中3。然而，宽场成像方式由于不能很好的对离焦区域的背景信号进行过滤，并且对光的散射敏感，所以其无法达到细胞分辨率。更难以对更精细的诸如树突，轴突，树突棘等结构进行观察。所以一直难以达到神经科学家满意。
于是，从大概15年前开始，世界上一些研究和开发双光子成像技术的研究组开始尝试将双光子显微镜这种在神经成像领域已经获得广泛应用的技术进行微型化。然而，目前只有为数不多的几个课题组报道了他们在微型双光子显微镜研制方面的进展: 在2001年，Denk 等的工作被认为是研制微型双光子显微镜的第一步4。然而，它仍然太过“巨大”（长7.5厘米，重25克），而且成像速度很慢。之后，其他一些课题组相继报道了不同的微型双光子系统。由于微型双光子显微镜一般需要利用光纤将飞秒激光导入到探头之中，而光纤由于存在诸如色散、截至模式、导通带宽等一系列限制，所以某一款光纤一般只允许一定带宽（一般为几十纳米）和特定中心波长的光传播。目前商业化的，可以用来进行飞秒光传输的空心光子晶体光纤（hollow-core Photonic Crystal Fiber， HC-PCF）种类非常有限。例如，全球最大的光子晶体光纤生产商NKT公司仅提供中心波长为800nm，1030nm，1300nm和1550nm的 HC-PCF。所有现有的微型双光子显微成像系统都是基于这几款光纤所限定的中心波长进行开发的。但是很遗憾的是，本文上述所提到的目前最广泛使用的 GcamP 指示剂需要920 nm的激光进行激发。所以先前的所有微型双光子都不能对 Gcamp 进行有效的成像。这限制了微型双光子显微镜的发展。
图2 微型双光子发展史上的几个典型工作。a、b、c、d分别选自参考文献4、5、6和7
所以，这些早期的微型化双光子显微镜都无法得到真正的使用和推广，其原因在于，若要制造出具有实用价值的微型双光子显微镜，比研制单光子微型显微镜复杂和困难的多得多。微型双光子显微镜需要需要解决如下几个关键技术难题：
1 如何将飞秒激光有效的导入微型显微镜；
2 如何在微型显微镜内进行扫描/图像重建；
3 如何在微型显微镜中进行高质量的激光汇聚，高效激发双光子信号。
4 如何有效的对荧光信号进行收集；
5 如何使整个系统在动物剧烈运动时仍保持稳定
6 在满足前5项条件下，重量是否足够轻，以致尽量小地对动物的活动造成影响；
我所在的课题组，是由北京大学分子医学研究所、信息科学技术学院、动态成像中心、生命科学学院、工学院联合中国人民解放军军事医学科学院组成跨学科团队。我们在程和平院士的带领下，在国家自然科学基金委国家重大科研仪器研制专项《超高时空分辨微型化双光子在体显微成像系统》的支持下，历经三年多的协同奋战，成功研制了新一代高速高分辨微型双光子荧光显微镜，并将其取名为FHIRM-TPM。原始论文于5月29日在线发表于自然杂志子刊Nature Methods8。在这项成果中，我们解决了上文所提及的早先微型化双光子显微镜研制中存在的问题，获取了小鼠在自由行为过程中大脑神经元和神经突触活动清晰、稳定的图像。
图3 FIRM-TPM示意图，来自8
新一代微型双光子荧光显微镜体积小，重仅2.2克，适于佩戴在小型动物头部，通过颅窗实时记录数十个神经元、上千个神经突触的动态信号。在大型动物上，还可望实现多探头佩戴、多颅窗不同脑区的长时程观测。相比单光子激发，双光子激发具有良好的光学断层、更深的生物组织穿透等优势，所以成像质量远优于目前领域内主导的、美国脑科学计划核心团队所研发的微型化宽场显微镜。其横向分辨率达到0.65μm，与商品化大型台式双光子荧光显微镜可相媲美；采用双轴对称高速微机电系统转镜扫描技术，成像帧频已达40Hz (256*256像素)，同时具备多区域随机扫描和每秒1万线的线扫描能力。最为重要的是，FHIRM-TPM 克服了先前限微型双光子显微镜应用的两个障碍。首先，我们定制设计的 HC-PCF 为920纳米飞秒激光脉冲提供了无畸变传输，这种改进让有效的激发例如 Thy1-GFP 和 GCaMP-6f 等常用荧光指示剂成为可能。第二，由于双光子点扫描显微镜的高空间分辨率和层切能力，安装到动物头上的微型双光子显微镜非常容易受到运动伪影的影响。为了解决这个问题，我们对整个系统进行了充分的优化：（a）使用柔软的新型光纤束SFB来使得动物运动引起的扭矩和拉拽力最小化，并不降低光子收集效率； （b）采用独立的可旋转连接器来连接光学探头上的光纤和电线，以使动物在自由探索期间线的扭曲和缠绕最小化；（c）使用高速成像以减少运动引起的帧内模糊。此外，我们在实验之前预先训练动物适应安装在其头骨上的微型显微镜，并滴加1.5％低熔点琼脂糖使其充满物镜和脑组织之间，这些措施都显著降低了探头与大脑之间的相对运动，进而改善了实验短期和长期的稳定性，于是实现了在动物进行包含大量身体和头部运动的行为学试验中中进行高分辨率成像。
图4 FIRM-TPM实物图8
树突棘活动是神经元信息处理的基本事件，利用台式双光子显微镜在头固定的动物上的研究表明单个神经细胞的不同树突棘可以被不同朝向的视觉刺激或不同强度频率的声音刺激所激活。FHIRM-TPM 实现了与传统的大型的台式双光子显微镜相同的分辨率和光学层切能力。与微型宽场显微镜相比，FIRM-TPM的高空间分辨率，固有的光学切片能力和组织穿透能力以及相当的机械稳定性都是极有优势的。所以虽然通过微型宽场显微镜可以获得数百个神经元在细胞水平上的活动，但是我们的 FHIRM-TPM 无疑提供了一个更加强大的工具，即在自由活动的动物中对更加基本的神经编码单位——树突棘的时空特性进行观测。它能够在对小鼠依次进行的行为学试验（例如悬尾，跳台，以及社交行为）的过程中长时间观察位大脑中的神经元胞体、树突和树突棘的活动。这些功能的展示充分证明了 FHIRM-TPM 具有良好的性能和稳定性。未来，与光遗传学技术的结合，可望在结构与功能成像的同时，精准地操控神经元和大脑神经回路的活动。微型双光子荧光显微镜整机性能十分稳定，可用于在动物觅食、跳台、打斗、嬉戏、睡眠等自然行为条件下，或者在学习前、学习中和学习后，长时程观察神经突触、神经元、神经网络、远程连接的脑区等多尺度、多层次动态变化。
图5 三种模式在结构学成像中的成像质量对比，来自8
图6 FHIRM-TPM在三种不同的行为学范例对小鼠大脑皮层神经元活动进行成像，来自8
纵观这15年来微型双光子显微镜的发展道路，中国，之前在这个领域基本上属于完全的空白。更不要说什么领先世界。然而令人十分兴奋的是，中国国家基金委国家重大科研仪器设备研制专项在2014年正式将“超高时空分辨微型双光子在体显微成像系统”立项，对这一项“世界上做的还并不怎么好，中国基本没人做过”的技术进行攻关研发。这样的大力投入无疑为这一领域注入了新鲜血液和十足动力。从2012年起，我正式加入了由首席负责人程和平院士和陈良怡研究员的联合课题组，开始对微型化显微镜技术进行研发。
该成果在2016年底美国神经科学年会、2017年5月冷泉港亚洲脑科学专题会议上报告后，得到包括多位诺贝尔奖获得者在内的国内外神经科学家的高度赞誉。冷泉港亚洲脑科学专题会议主席、美国著名神经科学家加州大学洛杉矶分校的Alcino J Silva教授在评述中写道，“从任何一个标准来看，这款显微镜都代表了一项重大技术发明，必将改变我们在自由活动动物中观察细胞和亚细胞结构的方式。它所开启的大门，甚至超越了神经元和树突成像。系统神经生物学正在进入一个新的时代，即通过对细胞群体中可辨识的细胞和亚细胞结构的复杂生物学事件进行成像观测，从而更加深刻地理解进化所造就的大脑环路实现复杂行为的核心工程学原理。毫无疑问，这项非凡的发明让我们向着这一目标迈进了一步。”
美国著名神经科学家 Alcino J Silva 发表了这样的评论
“By every standard, this microscope represents a fundamental discovery that willchange the way we image cellular and sub-cellular structures in behavinganimals. The doors that this microscope opens, go beyond imaging of neuronaland dendritic activity. Systems neuroscience is primed to enter a new era,where imaging of complex biological events in identified cells and subcellularstructures of cell ensembles, will bring us closer to the very engineeringprinciples that evolution designed to implement complex behaviors in braincircuits. This marvelous invention just got us a step closer to that goal.”
“从任何一个标准来看，这款显微镜都代表了一项重大技术发明，必将改变我们在自由活动动物中观察细胞和亚细胞结构的方式。它所开启的大门，甚至超越了神经元和树突成像。系统神经生物学正在进入一个新的时代，即通过对细胞群体中可辨识的细胞和亚细胞结构的复杂生物学事件进行成像观测，从而更加深刻地理解进化所造就的大脑环路实现复杂行为的核心工程学原理。毫无疑问，这项非凡的发明让我们向着这一目标迈进了一步。”
参考文献：
1. Minderer, M., Harvey, C.D., Donato, F.& Moser, E.I. Neuroscience: Virtual reality explored. Nature 533, 324-325(2016).
2. Hamel, E.J., Grewe,B.F., Parker, J.G. & Schnitzer, M.J. Cellular level brain imaging inbehaving mammals: an engineering approach.Neuron86, 140-159 (2015).
3. Ghosh, K.K. et al.Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nat Methods 8, 871-878(2011).
4. Helmchen, F., Fee,M.S., Tank, D.W. & Denk, W. A Miniature Head-Mounted Two-Photon Microscope.Neuron 31, 903-912 (2001).
5. Engelbrecht, C.J.,Johnston, R.S., Seibel, E.J. & Helmchen, F. Ultra-compact fiber-optictwo-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Optics Express 16, 5556 (2008).
6. Piyawattanametha, W.et al. In vivo brain imaging using a portable 2.9 g two-photon microscope basedon a microelectromechanical systems scanning mirror. Optics Letters 34, 2309(2009).
7. Sawinski, J. et al.Visually evoked activity in cortical cells imaged in freely moving animals. Proceedings of the National Academy ofSciences 106, 19557-19562(2009).
8. Zong, W. et al. Fasthigh-resolution miniature two-photon microscopy for brain imaging in freelybehaving mice. Nat Methods(2017).
