分离和培养人角膜内皮细胞实验
实验方法原理
实验材料 完整的人角膜
试剂、试剂盒 CMF-SalineG胰蛋白酶 EDTADMEM F-12 GASPDMEM F-12 2FB:DMEM:Ham’sF-12 1:1 含2%FBSCMF GASP
仪器、耗材 手术刀或单刃安全刀片弯虹膜剪 11cm(4-3 8 in.)Jeweler’s慑子 10cm(4 in.)角膜剪 19mm刃 尖头Colibri缝线钳0.1 mm
实验步骤
(a)用PBSA将角膜清洗3次,每次5 min。
(b)剪除残留的巩膜,结膜和虹膜。
(c)加人2 ml 1.2 U/ml中性蛋白酶II,4℃过夜,轻微搅动。
(d)将加人中性蛋白酶II的角膜放人4℃摇床摇30 min。
(e)用DMEM/F-12/GASP清洗角膜。
(f)解剖显微镜下,小心去除小梁网,剥离内皮层并用胰蛋白酶/EDTA消化37℃,30 min。
(g)加入同等体积的DMEM/F-12/2FB并拍散细胞。
(h)离心400g,10 min,弃去上清。
(i)加人1 ml培养基,轻柔的重悬细胞并计数。
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