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细胞培养过程常见问题

2021.6.04

1.为什么培养的细胞要及时传代？
答：体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性，也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长，及时传代后，细胞的生长得以继续。

2.培养液pH下降很快可能原因有哪些？其解决办法是什么？
答：通常细胞生长得非常快时，pH值通常下降得很快。此时可以及时传代、提高传代比例或降低血清量等方法进行解决。此外，培养瓶盖拧得太紧、NaHCO3 缓冲系统缓冲能力不够、培养液中盐浓度不正确、细菌、酵母或真菌污染等也能导致pH值通常下降得很快。

（1）按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度，2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3对应CO2浓度为5％到10％。
（2）改用不依赖CO2培养液。
（3）松开瓶盖1/4 圈。加HEPES 缓冲液至10 到25mM终浓度。
（4）在CO2 培养环境中改用基于Earle′s 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液。
（5）如果是污染造成的则丢弃培养物或用抗生素除菌。

3.培养液pH对细胞生长的影响？
答：由于大多数细胞适宜pH为7.2-7.4，偏离此范围可能对细胞生长将产生有害的影响。但各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受差，无限细胞系耐受力强。但总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些。在配制培养用液时，需要注意一点：培新配的培养基在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时，溶液的pH还会向上浮动0.2左右。

4.购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？
答：研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。但对于DMSO敏感的细胞，还是复苏细胞时，用离心去除DMSO比较好。

5.购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？
答：研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，原因比较复杂，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳；血清使用错误或血清的品质不佳；解冻过程错误；冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心；悬浮细胞误认为死细胞；培养温度使用错误；细胞置于–80 ℃太久等。建议严格参照ATCC或ECACC的标准操作规程进行细胞复苏、冻存等工作。

6.支原体污染会对细胞培养有何影响？
答：支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数、代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。

7.冷冻保存细胞之方法？
答：冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃（30－60 分钟）→-20℃( 30 分钟) → -80℃（16－18 小时或隔夜）→ 液氮罐长期储存。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3℃至–80 ℃以下，再放入液氮中长期储存。注意：-20℃不可超过1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

8.悬浮细胞应如何继代处理？
答：一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养瓶中，稀释细胞浓度即可。若培养液太多时可分瓶取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养瓶中，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。

9.欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？
答：欲回收动物细胞，其离心速率一般为300×g (约1,000rpm)，5 - 10 分钟，过高之转速过长时间都将造成细胞死亡。合适的离心转速是根据相对离心决定。 RCF=1.119×105×r×(rpm)2，其中 r为离心机转轴中心与离心套管底部内壁的距离；rpm为离心机每分钟的转数；RCF(relative eentrifugal force)为相对离心力，以重力加速度g（980.66cm/s2）的倍数来表示表示单位。

10.培养细胞时应使用5%还是10%CO2，或者根本没有影响？
答：一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7g时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5g时，则应使用5%CO2培养细胞。

11.细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？
答：除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养方瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

12.冷冻管应如何解冻？
答：取出冷冻管后，须立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1－2 分钟内大部分融化，特别注意，需残留一小块冰块，就可拿到超净工作台操作细胞，用75％消毒冻存管，用新鲜培养基将细胞转移至培养瓶。另外冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。

13.如何用台盼兰计数活细胞？
答：将样品适当稀释后，用稀释后的样品和0.4％的台盼兰溶液按1:1混合后，用移液枪点样到血球计数板，置于倒置显微镜下观察、计数，其中蓝色细胞是死细胞，因活细胞排斥台盼兰，不被染色。

14.细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
答：冷冻管内细胞数目一般为1-8×106 cells/ml vial。

15.细胞冷冻培养基之成份为何？
答：动物细胞冷冻保存时常使用的冷冻培养基是含9 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。

16.如何消除组织培养的污染？
答：当重要的培养细胞污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。
　　高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
1）在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
2）分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3）每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
4）确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2－3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2－3代。
5）在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6）重复步骤4。
7）在无抗生素的培养基中培养4－6代，确定污染是否以已被消除。

17.培养细胞出现死亡其可能的原因有什么？解决办法有哪些？
答：可能的原因有培养箱内无CO2；培养箱内温度波动太大；细胞冻存或复苏过程中损伤；培养液渗透压不正确；培养液种有毒代谢产物堆积等。解决办法可以检测培养箱内CO2浓度，检查培养箱内温度；取新的保存细胞种；检测培养液渗透压等；换入新鲜培养液等。

18.国内可以买到细胞株的地方有哪些？
答：可以从国内多家代理厂家买到ATCC或ECACC的细胞株，同时国内可以买到细胞株的地方还有中国医学科学院（协和医科大学）基础医学部，中国科学院细胞研究所以及武汉大学冷藏中心等。

19.细胞的渗透压耐受性是多少？
答：细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压290mOsm/kg, 可视为培养人体细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在320mOsm/kg左右。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在260－320mOsm/kg的范围都适宜。

20.支原体(mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？
答：不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。

21.怎样查到一个特定细胞株的相关知识和培养条件？
答：ATCC (American Type Culture Collection) 收集了绝大多数细胞的详细资料。打开ATCC网页的Cells and hybridomas链接，输入细胞名称就可以搜索ATCC的细胞数据库。数据库中有每一种细胞的详细描述，包括细胞的来源，培养和冻存条件，以及相关文献等资料。

22.为什么要在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液?
答：胰蛋白酶在4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。

细胞

丁香通

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