从层析荧光到微流控生物芯片——现场快速检验（POCT）...-2
1.3质量控制
图2所示是免疫层析产品的生产过程。首先在大张层析膜上喷画控制线和检测线，然后把此大张层析膜粘贴在支撑底衬上。这个过程必须要确保底衬和膜的接触紧密、均匀一直，否则将会导至不同测试条（卡）之间的液体流动速度和方式有很大的不同。下一步是粘贴胶体金垫、样品垫和吸水垫。吸水垫和胶体金垫各自和硝酸纤维膜有部分交叠，样品垫覆盖了胶体金垫的一部分。这里面最需要注意的是各层之间的交叠、接触需要密切、均匀，不能在任何膜层表面引入物理变形、污染物、或者化学杂质。很多和液体流动均匀性有关的问题都和以上这几个过程有关。最后一步是在温度和湿度都受控的房间里，把上面制作的大张材料切割成一条条的试纸条，组装入塑料壳。
图2 免疫层析产品的制造过程
从上面的制造过程可以看出，同一大张材料上切割出来的测试卡的一致性会比较好，因为是在同一个时间、同一个环境条件、用同一片材料、同一次制作过程完成的。比较难以控制的是不同批次间的差别。所以质量控制也应该主要关注批间差。
建议质量控制流程如下：
保留最少18个质量有保证的测试卡。
准备最少两个浓度的样本，一个是在cut-off值附近，另一个是中值。
如果有检测全血、血清、血浆等不同样本的需求，则需要按照2来准备不同的样本。
每个浓度点测试3个卡，计算平均值。
如果平均值相差超过10%，则新批次测试卡不合格。
如果使用温度和室温（25℃）相差较大，则需要和室温结果比对。
以上第二项考虑的是，如果测试卡存在问题，那问题在cut-off值附近会被放大。第三项的考虑是不同的样本黏稠度不同，对胶体金垫上颗粒的稀释能力会不同，在硝酸纤维膜里的流动速度会有差别。而从前面的讨论我们知道，样本在膜中的流动速度是对测试结果影响最大的因素之一。第四点、第五点考虑的原因是，免疫检测不可能100%完全重复，需要平均并给与一定的误差量。
值得一提的是，胶体金免疫层析、荧光免疫层析、上转发光免疫层析这三种产品都是建立在“层析”这个技术平台上，所以以上的讨论对三种技术均适用。但是，荧光的使用使检测灵敏度得到了一定程度的提升。荧光免疫层析的一个很大的问题是散射的入射光对检测信号的干扰，而使用上转发光可以有效地消除这个问题。
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微流体技术
从上面的讨论我们可以知道，层析检测技术是一项看起来很简单、但是实际上很复杂的技术。里面最少有4种薄膜、两种抗体、抗体修饰的胶体金颗粒、缓冲液、封闭液等。制造过程最难把控的因素来源于：①把各种生化试剂载入相应的材料中并进行干燥；②把各种材料完美、重复的组装在一起。任何存在于各层材料之间的界面缺陷和界面不重复性都会直接导至检测结果的重复性变差甚至失败。解决这些问题的一种办法就是摈弃层析这个平台。美国Alere公司qixia的Triage产品系列就是采取了这样一种方略。
图3 Biosite微流体测试卡结构
图3所示是美国Alere公司qixia的Triage产品系列的测试卡结构，其中没有任何的薄膜材料。它有上下两层材料组成，两层材料之间的距离是可以产生毛细现象的距离。上层为高度透明材料，目的是可以使在两层材料之间产生的荧光信号不受干扰地传播到透明材料另一侧的荧光检测器件上。底层表面的地貌随需求变化而不同，而最突出的特征就是“搓衣板”地貌。这样一个“搓衣板”地貌可以有效的增加表面积、增加抗体固定量及固定强度。在测试区域的表面上修饰的主要是捕捉抗体和封闭试剂，在样本准备区域的不同部位上修饰有荧光标记物、检测抗体、缓冲试剂、封闭试剂等。样本进入测试卡以后，其中液体溶解各种生化试剂，毛细作用推动试剂向检测区流动。
把一根细细的玻璃管的一端垂直放进一个水盘子里，水在玻璃管里面就会因毛细作用而上升，上升的高度可以由Jurin定律来计算[4]：
其中
是液体-空气表面张力，
是液体和玻璃管表面的接触角度，
是液体密度，g是万有引力常数，r是玻璃管的直径。由上面的公式可以看出，毛细作用的大小和管子的直径成反比关系，直径越大，毛细现象越小。这一现象被Biosite用来调节试剂在测试卡里的流动速度。图三b的右侧结构中有一凹槽，这一凹槽被用来较长时间地滞留样本，使样本有足够的时间和荧光标记物、检测抗体、缓冲试剂等充分的混合反应。滞留时间可以由凹槽的深度来调节。
其他3个参数
,
,
均和样本有关，并且和温度有关。在20 ℃的条件下，水的
= 0.0728 N/m，
= 1000 kg/m3，这些数据可以粗略用来近似偏水性的样本，但是对于油脂含量比较高的黏稠样本，
,
,
的数值会有所不同，导至试剂流动速度不同，因而测试结果不同。
上述问题的主要原因是，毛细现象是一种自然界发生的被动现象，会随着环境条件及液体特性而发生变化。要想解决这个问题，就必须对微流体进行控制。理邦的m16磁敏免疫检测平台采用的就是这个理念。图3所示是理邦m16产品系列微流控测试卡流体线路图。在这里称之为微流“控”而非微流“体”是因为它对微流体的流动实现了控制的功能。在这个微流控结构里共有三个线性微流体泵，分别对三种试剂进行控制。根据理邦提供的数据，驱动装置是由步进电机构成，每1 mm的驱动距离可以分为25000步，也就是说，每一步的驱动位移是40 nm。微流体泵体的直径大约是3 mm。换算成体积，步进电机每走一步所移动的试剂体积是0.0028μL，实现了精确控制。因为是微流体泵控制的流动，也因此避免了因样本组分或黏稠度不同而导至流速不同、测试结果不同的问题。另外，因为速度是可以调节的，所以可以针对不同的检测项目（心肌标志物、炎症、传染病）进行优化，以达到最佳检测结果。
图3 理邦m16微流控测试卡结构
在前面所描述的层析和毛细微流体平台中，样本中的液体作为溶剂把各种生化材料溶解在一起流到反应区域。在检测区和背景区域结合上的非特异信号物是靠最后残留的多余样本进行清洗，没有专用清洗液体。在这两个方面，m16平台采取了完全不同的方案。为了避免各种试剂之间的相互干扰或交叉反应，m16微流控测试卡采用了3个微流体泵，对不同的试剂依次分别注入反应。在注入不同的试剂之前，微流体泵驱动的清洗液对反应空间进行彻底清洗，有效的消除非特异吸附。m16的另一个独特之处是微流体泵不仅可以控制试剂和样本的流动速度，而且可以控制其流动方向。反应试剂可以前后来回震荡，增加反应结合律也即检测灵敏度，清洗试剂可以通过来回震荡来达到彻底清洗的目的。
