什么是“组织化学”
组织化学是指以常用的组织化学技术,对细胞内主要化学成分和活性的粗略(一般性)的研究.
概要介绍如下:
一,______ 核酸(DNA和RNA)
(一)__ 化学特性
1.分布: DNA (细胞核内)
RNA(核仁10% ;细胞质-核糖体90%)
2. 分子结构:戊糖 + 磷酸 + 碱基
特点:① 大量的磷酸基团→酸性
(嗜碱性的基础)
② 戊糖—被盐酸水解→醛基
(成为Feulgen法显示核酸的基础)
② 戊糖—被盐酸水解→醛基 (成为Feulgen法显示核酸的基础)
③ 可以完全水解或部分水解
④ 可以用RNAase或DNAase消化
[ 对照实验(—)]
_
(一)__ 显示方法
1. 福尔根(Feulgen)反应显示DNA
[ 原理 ] 在60℃温度下,将DNA用1N盐酸水解,DNA双链打开成单链,先释出碱基,然后脱氧核糖释出醛基,该醛基与Schiff氏液形成紫红色沉淀.
[ Schiff试剂显色原理 ]
碱性品红 亚硫酸 → 白亚黄酸
(无色试剂,称为Schiff试剂)
[方法]
固定剂的选择可用一般的组织学固定液,常
用Carnoy固定液.
Carnoy固定液:
纯酒: 氯仿: 冰醋酸 = 6:3:1
(60ml) (30ml) (10ml)
恒冷箱切片机的具体染色步骤如下:
⑴ 切片固定在冰醋酸与纯乙醇(1:3 V/V)
中10分钟.
⑵ 由乙醇降至蒸馏水中.
⑶ 用1N盐酸浸泡.
⑷ 放入预热到60℃的1N盐酸中,留6分钟.
⑸ 放入室温的1N盐酸中.
⑹ 放入Schiff液试剂,保持在暗处,60分钟
⑺ 用新配制的SO2水浸洗3次(脱掉未反应
的Schiff液).
⑻ 蒸馏水浸洗净(必须用蒸馏水→洗净无色品红,
否则,残留试剂→有色品红).
⑼ 脱水透明,封固.
结果:核内DNA染为红紫色.
对照:仅改变第4步为1N盐酸,室温15分钟→(-).
[ 注意事项 ]
⑴ 不用醛类固定剂如Bouin,戊二醛,丙烯醛等.
常用Carnoy液,甲醇等.
⑵ 控制水解时间,不同的固定剂用不同的时间,
如:Carnoy 8分钟;Genker 5分钟;
Susa 18分钟 ★ 最适条件应自行试验.
⑶ 控制温度,一般1N盐酸60℃;
如果5N盐酸18～25度.
⑷ 保证Schiff试剂的纯净度.
⑸ SO2要新配制,除去多余的 Schiff液宜用之.
⑹ 必须对照.
2._ 显示核酸的其它方法
⑴ Kurnick甲绿Methylgreen显示DNA法
⑵ 甲绿派若宁Methy green-Pyronin显示DNA和
RNA法
⑶ 菊花青铬明矾(GC)显示核酸法
⑷ 丫啶橙Acridine Orange显示DNA和RNA法
⑸ 核酸提取法
_一,______ 蛋白质(Protein)
_
(一)蛋白质的分子结构
蛋白质的基本单位是氨基酸,肽键将不同的氨基酸结合在一起,除氨基和羧基之外,还含有其它基团,如:—羟基,硫氢基,二硫基等.依其结构特点可分为:酸性氨基酸 和碱性氨基酸 ;芳香族氨基酸:苯丙氨基酸,酪氨基酸;杂环类氨基酸:组氨基酸,色氨基酸,亚氨基酸,脯氨基酸,羟脯氨基酸.
_
(二)目前应用
1._ 用于蛋白质的一般定性
① 确定是否为蛋白质
② 确定蛋白质的酸碱性
③ 显示蛋白质的特殊基团
2._ 用于蛋白质功能定性和定位
_(三)染色方法
目前,研究蛋白质功能定性和定位时多用酶
组织化学法,配体—受体结合法,免疫组化法以
显示特殊的蛋白质.这里仅介绍一般的染色方法.
1.四氮化联邻茴香胺法
(Tetra-azotized-o-anisidine)
[ 应用 ] 广泛应用于显示酶的活性
[ 原理 ] 芳香伯胺与亚硝酸作用,在低温下(<
5℃)可生成重氮盐,此即重氮反应.重氮盐可
与酚类作用生成有色化合物——偶氮化合物.上
述反应必须在酸性条件下进行.
本实验,联邻茴香胺在酸性,低温条件
下与亚硝酸作用生成四氮盐.四氮盐有两个
重氮盐,其中一个重氮基在碱性条件下与所
要显示的组氨酸,色氨酸及酪氨酸的苯环结
合产生偶联反应,另一个重氮基与酚类或奈
类发生偶联反应以增色.因此,可以用生成
的偶氮染料来代表组织细胞的蛋白质含量.
[ 方法 ]
1._ 四氮盐配制
⑴ 天平称取联邻茴香胺0.25g(有毒,通
风橱内进行).
⑵ 在冰浴下,加入已预冷8%盐酸10ml,
玻璃搅拌,促其溶解,混合后为悬浊液.
⑶ 称NaNO2 0.15g溶于1ml蒸馏水中(冰浴
下).
⑷在冰浴下,将配好的NaNO2溶液分三次倒入邻联茴香胺悬浊液内,每次倒入都须玻棒搅动,因产生NO2可有黄烟冒出,至黄烟停止再倒下一次液体.放入冰箱(4℃)内,约20分钟,待溶液变为黄色.
⑸倾出上清液,勿将沉渣泛起,弃去沉渣.
⑹用NaHCO3细粉(约0.5～0.6g)逐渐加
入上清液内,边加边搅拌(冰浴下).
⑺以刚果红试纸测中和点,待试纸不变蓝即达到中和.收集于标本瓶(或广口瓶)内,置冰箱备用.此液不稳定,置冰箱内可保存两周,若变为橘红色则失效.
_
2._ 偶氮反应
—Carnoy固定的大鼠肝,肠等石蜡切片.
⑴ 切片脱蜡至水.
⑵ 将切片放入下列溶液中(在冰浴中至2～3℃),
浸染10分钟.
用前配制:
四氮化联邻茴香胺溶液 4ml
0.1巴比妥缓冲液 (pH9.2) 20ml
24ml
⑶ 入1N盐酸(冰浴中2～3℃)浸洗10秒,多余盐
酸以滤纸吸干.
⑷ 入H酸饱和液,浸染30分钟(冰浴或冰
箱内).
H酸饱和液配制:H酸 0.4g
0.1M巴比妥缓冲液 20ml
(pH9.2) 过滤后使用!
⑸ 蒸馏水冲洗,脱水,透明,封固(树胶)
[ 结果 ]
酪氨酸,组氨酸,色氨酸染成红棕色(+)
※ 0.1M巴比妥钠50ml配制
① 分析天平称巴比妥钠(MW=206.18)
1.0309g
② 于量瓶内+蒸馏水50ml至刻度即可.
0.1M巴比妥缓冲液,pH9.2(20ml)配
制: 0.1M巴比妥钠 19.1ml
0.1N盐酸 0.9 ml
20 ml
2.其它的显示蛋白质的方法
⑴ 米朗反应(Millon Reastion)→显示酪氨
酸的方法
酪氨酸→羟苯基 亚硝酸 →亚硝基苯+Hg→有色物
注:胶原蛋白不显色,其它蛋白质都显色(+)
⑵二硝基氟苯Dinitro—fluoro—benzene (DNFB)法
DNFB与—NH2,SH和酪氨酸产生弱有色反应,
可被偶氮染料加强.
⑶ 酪氨酸重氮化偶联反应
⑷ 蛋白质硫氢基DDD法(固定时避免
氧化剂)
⑸ 铁—铁氰化钾反应显示SH基
⑹ 高甲酸阿尔辛蓝显示SS基法
⑺ 免疫荧光法显示蛋白质
三,碳水化合物
中性多糖——糖原
碳水化合物 酸性多糖——硫酸软骨素 A,B,
C,肝素,硫酸角
(组织中—多糖类) 质素,透明质酸等
蛋白多糖——粘蛋白,唾酸粘蛋白
糖 脂——脑苷脂类
※ 组织中糖的种类较多,因此,要特异性地显示各种
糖类必须用抑制和酶水解来对照实验.
本章仅以高碘酸雪夫法(PAS法)说明之,其它的
方法还有Alcian blue法,甲苯胺蓝异染性染色法等.
高碘酸雪夫法 Periodic—Schiff(PAS)method
[ 原理 ] 高碘酸为强氧化剂,它可以氧化多糖
分子内1,2—乙二醇(顺式和反式)而
产生醛基,此醛基再与Schiff试剂结合即
产生红 紫色.
[ 方法 ] 改良的McManus(1946),高碘酸雪夫法
标本:
① Carnoy固定的大白鼠肝,肾,肠石蜡切片
② 大白鼠肝横冷箱切片(未固定)
[ 步骤 ]
(1) 切片脱蜡入水(横冷箱切片免)
(2) 入0.5%高碘酸水溶液,室温,2～5分钟
(3) 蒸馏水涮洗
(4) 入Schiff试剂,洗3次,每次2分钟
(5) 入SO2水中,洗3次,每次2分钟
(6) 自来水洗5～10分钟
(7) 蒸馏水稍洗
(8)入Mayer氏苏木精副复染核1分钟
(9) 自来水5分钟,换蒸馏水
(10)脱水,透明,封固
[ 结果 ]
PAS(+)→红紫色或红色;核→蓝色
Carnoy固定,糖原原位定位不佳,有
移位现象.
[ 对照 ]
① 用唾液酸淀粉于37℃消化20～30分钟.
② 苯甲酰或乙酰化法作对照(抑制法)
[ 注意事项 ]
①必须按照规定配方配制试剂,按规定的时间 反应.以避免非特异反应.例如:入高碘酸水溶液时间不宜过长,否则非特异着色.
②多糖大多都易溶于水,固定时应避免扩散或移位.
冰冻切片+苦味酸福尔马林→固定→避免扩散或移位.
③注意溶液的pH值:高碘酸液的pH不应超过5.
④注意温度.反应宜在<25℃的室温下进行,否则可氧化醛基为羧酸.
⑤高碘酸溶液的浓度宜控制在0.5%～1%(0.02—0.1M)浓度过高则会发生非特
异反应.
⑥为充分显示多糖中的糖原,可在过碘酸
中加入5%醋酸或纯乙醇固定,但往往有
溶解和扩散.
⑦为阻止胶原纤维和网状纤维阳性反应,
可使用还原液,于使用Schiff液之前.
[ 分析结果 ] PAS反应阳性物质:糖原,中
性粘蛋白,中性唾液性粘蛋白.
四,脂类
[ 组织中的脂类 ]
单纯脂类 脂肪酸
醇的化合物(如:甘油三脂等)
复合脂类 磷脂(卵磷脂,脑磷脂)
脂类 鞘磷脂
糖脂(脑苷脂,神经苷脂)
衍生脂类 胆固醇
肾上腺素
性激素
[ 显示脂类的基本原理 ]
用易溶于脂类的染料,使之溶于所检
的脂质(如脂滴)中,使组织内的脂类着色.
[ 常用方法 ]
苏丹黑B法,油红O法,硫酸尼罗蓝法
[ 基本要求 ]
⑴ 不用石蜡切片.
⑵ 固定剂一般用Formalin保存磷脂较好.
⑶ 方法:
① 物理法:脂溶性染料,不溶于水,属偶
氮染料.常用苏丹Ⅲ,Ⅳ,苏
丹黑 ,油红O等.
② 化学方法:硫酸尼罗蓝显示脂肪酸.
③ 选择性提取法(对照)
实验举例:苏丹黑B法
[ 原理 ]
苏丹黑为偶氮染料,具有脂溶性,可
溶于无水酒精,但不溶于水(常用70%酒
精饱和液).当组织切片入染液时,苏丹
黑B便离开染液而溶于组织内的脂质(如脂
滴中)使组织内脂类着色.
标本:
兔肾上腺和睾丸横冷箱切片,10μm厚,不
固定(或用10%Formalin固定10分钟后水洗).
[ 方法 ]
① 入蒸馏水洗
② 于70%乙醇内涮洗
③ 入苏丹黑B 70%B饱和液,染5～10分钟
④ 于50%酒精内浸洗
⑤ 蒸馏水中洗
⑥ 入Mayer苏木精(复染细胞核)1分钟
⑦ 自来水冲洗5～10分钟
⑧ 入蒸馏水
⑨ 甘油明胶(或Apathy糖胶)封固
[ 结果 ] 细胞内脂滴均呈黑色
