TRAP法端粒酶活性检测实验操作方法及疑难解答
Kim应当不会预测到，他在1994年发明的TRAP会那么受欢迎，被一代又一代的研究者奉为端粒酶 活性检测首选方法。不过，TRAP法虽然灵敏度高，却同样存在瑕疵。下面为大家介绍的是根据TRAP法适当改良的研究专用试剂盒具体情况和使用方法以及常见问题解答。
本品与通常的端粒 酶活性测定法相比较，具有以下特征
·内标与端粒酶提取液在同一管里进行PCR 扩增，提高了检测的准确性。
·提供了阳性对照，可以更加准确地判定阳性实验结果。
·优化了引物设计，使PCR 效果进一步提高。
使用须知
本试剂盒为研究用试剂，不能将其作为诊断或临床检测试剂使用。
背景知识
端粒酶是合成染色体末端的端粒的酶。端粒(telomere)是真核细胞染色体的天然末端，由上千个6 碱基重复序列(TTAGGG)组成，是细胞必需的遗传组分，它的作用是维持端粒有足够的长度，保证基因信息在复制过程中的准确性，以防止染色体末端遗传信息的丢失。
在正常情况下，每个细胞分裂周期都会使端粒变的越来越短，当端粒短到一定程度时就会发出信号，细胞停止分裂。
端粒酶由RNA 和蛋白质亚基组成，是基本的核蛋白逆转录酶，在细胞染色体复制过程中，能够以自身RNA 为模板，在染色体3’末端合成重复序列，维持端粒的长度。端粒酶在正常体细胞中的活性被抑制，但是大量的资料表明在一些恶性肿瘤中的表达高达85%。
由于端粒酶特异地表达于各种肿瘤细胞，并且是大多数肿瘤细胞持续分裂所必需的。因此，端粒酶活性是诊断多数恶性肿瘤、判断愈后的良好指标。
基本原理
利用端粒酶在体外可以以其自身RNA 的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6 个碱基的重复序列的特性，采用PCR 方法扩增此重复序列，并进而用聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳显示6 个碱基差异的梯带。
1994 年Kim 建立的TRAP 法，其主要原理如下：首先合成一个18nt 的TS 做上游引物，端粒酶结合TS 末端的GTT 并合成AGGGTTAG，然后每经过一次转位合成一个ggttag 的6 碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入CX 做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。
我公司提供的PCR端粒酶活性检测试剂盒基于同样的的原理，利用银染技术检测端粒酶的活性。阳性结果在凝胶电泳上显示相隔6bp 的梯状条带，条带的多、寡、深或浅表示端粒酶活性的大小。
TRAP-银染法保留了传统TRAP 法灵敏度高、特异性强等优点，避免了同位素的放射污染。同时，还增设了内标准物，提供阳性对照品，优化了引物设计，使PCR效果进一步提高，使之能够高灵敏的检测到细胞和组织提取物中端粒酶的活性。
TRAP-银染法端粒酶活性检测试剂实验方法
试剂盒组份
组分 50 次实验量
Wash buffer 11ml
Lysis buffer 2.2ml
10×PCR buffer 140μl
dNTPs 165μl
Primer1 165μl
Primer2 28μl
Primer3 110μl
Taq -DNA Polymerase 17μl
ddH2O 750μl
阳性对照模板 55μl
内标准模板 55μl
操作步骤
1、端粒酶的提取
⑴ 手术后取下的活组织，立即保存在液氮之中。
⑵ 40～100mg 冷冻(-70%℃)组织用无菌眼科手术剪尽量剪碎，研磨器研磨，加入40 ul Lysis buffer(使用前每ml Lysis buffer 加入2μlβ-巯基乙醇);或1～2×106 沉淀细胞直接加入40μl 预冷的Lysis buffer，悬浮细胞，涡旋振荡10s, 置冰浴中30min，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6 次。
备注：为了获取比较理想的端粒酶提取液，建议在一些干硬组织中适当加入Washbuffer。
⑶ 4℃离心(13000rpm,20min)。
⑷ 移取上清，分装3-4 管，每管约20μl。其中一份样品用于蛋白质浓度定量，其余迅速冷冻，-70℃保存。
2、 PCR 扩增(1×25ul)
Ⅰ液(μl) Ⅱ液(μl)
ddH2O 7.5 5.5
10×buffer 0.5 2
dNTPs 0.5 2.5
Primer1 0.5 2.5
Primer 2 0 0.5
Taq-DNA polymerase 0 0.3
内标准模板 1 1
Primer 3 2 2
3、 PCR 扩增：
⑴ 每管加入Ⅰ液9μl 及端粒酶提取液1μl，混匀，30℃反应30min。
⑵ 上述各管93℃加热1min 灭活。
⑶ 向上述各管中加入预热至93℃的Ⅱ液各13ul，混匀，进行第一步扩增。扩增
条件如下：
第一步：
步骤 时间 温度
预变性 3m 93℃
变性 35s 93℃
退火 35s 42℃
延伸 90s 72℃
循环数 5
延伸 60s 72℃
⑷ 在第一步扩增最后一个循环的延伸一步的最后几秒，暂停仪器运行，快速向各管中加入primer3 2ul 和内标准模板1ul。继续运行仪器，进行第二步扩增。扩增条件如下：
第二步(连接第一步)：
步骤 时间 温度
预变性 60s 93℃
变性 40s 93℃
退火 40s 60℃
延伸 50s 72℃
循环数 36
延伸 8m 72℃
4、 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(所有溶液，用户自备)
⑴ 制备10%非变性聚丙烯酰胺凝胶(20ml)。
ddH2O 11.19 ml
36%Acr-1%Bis 5.46 ml
5%TEMED 0.4 ml
10×电泳缓冲液 2 ml
1.25% APS 1 ml
⑵ 取10ul PCR 产物与2ul 上样缓冲液混合后加样，用0.5×电泳缓冲液作为电极缓冲液，180V 电泳2h。
⑶ 小心剥离凝胶，并置于50%甲醇、10%醋酸中，固定过夜。
备注：① 10×电泳缓冲液：15g Tris 、14g 硼酸和1.17g EDTA (不带2Na) ，用ddH2O 定容至200ml。
② 10×上样缓冲液：0.01%溴酚兰、40%甘油、62.5mM Tris-HCl(pH 6.7)
5、银染(所有溶液，用户自备)
⑴ 将凝胶置于10%醋酸固定30min 后用蒸馏水漂洗3 次，每次5min;
⑵ 将凝胶置于0.2g/L 硫代硫酸钠浸泡1min, 然后用蒸馏水漂洗3 次，每次30s;
⑶ 将凝胶置于硝酸银染液中浸泡30min, 然后用蒸馏水漂洗30s;
⑷ 将凝胶置于显影液中显色10min 左右直到全部条带显色清晰为止;
⑸ 将凝胶置于5%醋酸中浸泡终止反应。
⑹ 选择适当时机照相。
备注：
① 硝酸银染液：0.2g AgON3、25ul 37%甲醛，定容至100ml。
② 显色液：3g Na2CO3、25ul 37%甲醛、0.4mg 硫代硫酸钠，定容至100ml。
6、使用凝胶分析软件进行结果分析
实验方法的说明
1 端粒酶的提取： 端粒酶本身有RNA 和酶功能基团，极其容易被降解、失活。因此，应该按提取细胞总RNA 的要求，尽量在低温条件下，快速操作。简化不必要的反复洗涤程序，
提高提取液的蛋白质浓度。小量分装，尽量避免反复冻融。
2 反应前，测定每个样品的蛋白质浓度，并稀释至同一浓度，以保证端粒酶样品加入量基本一致。
3 为了让实验更具有客观性，实验时，请务必设定阳性对照和阴性对照，本试剂盒提供阳性对照的模板，并提供阴性对照的实验方法。
阳性对照的实验方法：另设一阳性对照管，以阳性对照模板代替端粒酶提取液加入即可。
阴性对照的实验方法：可以把Ⅰ液Ⅱ液混合，每管24ul 混合液，再加入端粒酶提取液，混匀后直接在90℃加热10min 灭活，不经过PCR 扩增，直接电泳，以排除样品中存在的蛋白质对核酸银染的干扰。
4 关于内标准模板的使用 为了便于进行各样品间端粒酶活性的比较，我们提供了内标准物。该内标准物可以作为模板，用于检测端粒酶活性的同一对引物进行扩增。内标准模板扩增片段长度为：50bp。该内标准物的使用有两种方法：
第一种方法：将内标准物以一定量加入到端粒酶样品之中，用同一对引物在同一扩增管内进行竞争性扩增。然后通过比较电泳图谱中内标准物和端粒酶扩增带的相对强度，即可达到相对定量的目的。考虑到实验方法的灵敏度，并避免PCR 扩增时的平台效应，只有当端粒酶的模板(与其活性相对应)和内标的模板比例相接近时，方能得到较理想的分析效果。
基于不同来源样品的端粒酶的活性不同，需要将高浓度的模板进行一系列的稀释，比如依次稀释为100、1000、10000、100000、1000000 等倍数，分别取1ul 与等体积的端粒酶样品混合后作为模板，进行扩增。选择一个内标准物和端粒酶均能明显扩增的稀释度用于今后的实验。此种方法从理论上讲更严谨，考虑到了模板的长度，扩增效果和端粒酶活性的关系，但是需要客户自己摸索最佳条件。
第二种方法：是将我们提供的高浓度内标准物，在进行电泳时加入。这样也能够实现半定量分析，而且方法简单可行。
常见问题
1. 细胞提取物中没有足够的端粒酶：在冰浴条件下制备细胞和组织提取物，尽量缩短制备时间，适当用较高浓度的端粒酶样品，减少不必要的操作。
2. 端粒酶的反应时间不够：保证反应时间不少于20min。
3. 所有样品和阴性对照都成阳性：PCR 残余污染。PCR 反应的每一组分勿重复使用保证使用洁净的PCR 管和PCR 试管架
4. 同一种组织会有不同的端粒酶的表达活性：动物本身就有种内差，每个个体的端粒酶的表达活性情况也会不一样。 同一个体的不同组织(如睾丸/骨髓)端粒酶的表达也不一定相同。同一个体的同一组织的不同部位端粒酶的表达情况也不一定相同。
5. 肿瘤组织中没有出现预期的端粒酶条带：肿瘤组织中端粒酶的表达达85%，也有部分肿瘤组织中没有端粒酶的表达，所以极少数肿瘤组织中有可能没有出现端粒酶的条带。
6. 阳性对照中看不到梯度：因反复冻融会导致阳性对照中的端粒酶失活，所以应注意低温操作。
7. 阴性对照里有梯度条带出现：PCR 产物、buffer A 及反应试剂等交叉污染，请将PCR 扩增产物提取区域和反应试剂配制区域分开。另外请经常使用手套。电泳上样时的交叉污染，每次上样时更换枪头。
8. 由于热处理、RNase 处理不充分而引起梯度条带消失：将要使用的枪头用DEPC 水浸泡至少24 小时，再进行高压灭菌，烤干;提取样品所用的玻璃制品、陶瓷品及手术器械等经烤箱170℃烘烤5 个小时。
9. 端粒酶活性不高：改善端粒酶反应条件，适当增加端粒酶反应时间，适当增加PCR 循环数(但要避免达到平台效应，使非特异性扩增大量出现)，避免buffer A 的恶化，尽量减少端粒酶样品反复冻融。实验操作的指导原则是快速，低温。
质量检测报告
产品名称：TRAP-银染法端粒酶活性检测试剂盒(TRAP-Silver Staining Telomerase DetectionKit)
HL-60 细胞在37℃，5%CO2 培养箱培养，并利用本试剂盒进行检测，经电泳检测PCR产物，呈现阳性梯带，视为合格。
端粒酶的提取应按总RNA 的要求操作，尽量在低温条件下，快速操作。端粒酶的反应时间应不少于二十分钟，为避免PCR残余污染，应保证实验中用到的试剂及仪器、管子洗涤干净，而且上样时注意更换枪头
