在CRISPR/Cas9相关研究中应用高通量测序技术（一）
摘要：
CRISPR/Cas9基因组编辑技术和新一代测序技术（也称高通量测序技术），是当今对生命科学研究有重大影响的两项技术。二者并非毫不相干。有效地将二者联用，有时可以大大加速科研进程。两者之间有什么样的联系呢？在哪些研究领域或方向上可以联用呢？上海伯豪生物根据在这两个领域的技术服务经验，对相关内容进行了系统地整理。
一．引言
在分子生物学的发展历史中，人们曾经不止一次地从微生物的某些生命活动中得到启示，发展出了对于DNA操作有重要意义的工具，如分子克隆用的限制性内切酶和PCR用的耐热聚合酶。它们为分子生物学的发展带来了革命性的影响。近两三年来，另一种从细菌的获得性免疫系统发展而来的革命性的基因操作工具CRISPR/Cas9受到广泛关注，其应用和影响范围仍在不断扩大。CRISPR/Cas9系统的发现与DNA测序技术分不开，它的发展与推广仍然得益于DNA测序技术。CRISPR/Cas9技术与近五、六年来同样快速发展的DNA新一代测序技术（Next
Generation Sequencing, NGS,
也称高通量测序技术）相结合，不但可以使研究者高效快速地得到一些实验结果，也拓宽了这一技术的应用范围。
二．CRISPR/Cas9系统简介
CRISPR/Cas9技术的产生与DNA测序技术的进步密不可分。1987年在对大肠杆菌E.coli K12的一个区段的测序结果的分析中，研究者首次发现细菌了碱性磷酸酶基因附近存在着成簇的规律间隔的短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat, CRISPR）。在接下来的十多年间，随着DNA测序技术的飞速发展，微生物基因组测序数据显著增多，更多的CRISPR在细菌和古细菌中被发现。据估计40%的细菌和90%的古细菌基因组具有CRISPR结构。CRISPR 由一系列短的高度保守的正向重复序列(repeats) 与长度相似的间隔序列（spacers）间隔排列组成（见图1）。本世纪初，CRISPR位点附近的、高度保守的Cas基因（CRISPR-associated genes）引起了研究者关注。Cas基因是一类基因家族，编码的蛋白具有与核酸结合功和核酸酶、聚合酶、解旋酶等活性。2005年，得益于病毒、质粒测序数据的日益丰富，通过对测序数据的系统分析，研究者推测间隔序列可能与外来的病毒、质粒有关。通过一系列的研究，人们认识到Cas基因可以与CRISPR序列协同作用，使细菌对病毒具有获得性免疫功能，而间隔序列则编码引导Cas蛋白定位的向导RNA的部分区段。
图1. 基因组CRISPR位点。摘自Doudna JA,
Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genome engineering
with CRISPR-Cas9. Science. 2014 Nov 28;346 (6213) :1258096.
根据Cas基因的不同，人们将CRISPR/Cas系统分为I-III三类。其中II类CRISPR/Cas系统包含一个Cas9蛋白。这类系统最先在改造后用于小鼠和人类基因组编辑，同时也是目前研究最为充分的系统。它只需要单独的Cas9蛋白即可在gRNA（guide RNA）的引导下完成对DNA的定点切割。Cas9蛋白可以通过突变改造为具有不同功能的衍生蛋白，例如只具有DNA结合功能而无切割功能的dCas9和只具有单链切割功能的Cas9n（也称nCas9） 等。Cas9蛋白行使功能需CRISPR转录而来的crRNA与反式激活的、与CRISPR 重复区互补的tracrRNA （trans-activating crRNA，tracrRNA） 形成的复合物参与。为了操作简便，研究者将crRNA和tracrRNA 融合进同一条单链中，设计出单链引导RNA（single guide RNA，sgRNA）。对靶序列有效的切割还需靶序列相邻的原型间隔序列毗邻基序，即PAM （protospacer-associated motif）。图2显示了CRISPR/Cas9 系统的主要元件。为了增强系统的特异性或实现某些特定的功能，除了前面提到的对Cas9蛋白的改造外，一些实验室还对有的元件进行了其它方面的改进。
图2. RNA
引导Cas9与目标DNA结合并将其切割。摘自Doudna JA, Charpentier E. Genome editing. The new
frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014 Nov
28;346(6213) :1258096.
三．CRISPR/Cas9技术的应用领域
对生物体包括人类自身的基因组进行高效自由地操作是许多生命科学和医学工作者的梦想。与传统的基因打靶、ZFN和TALEN等基因组操作技术相比，CRISPR/Cas9技术简单、高效，也不失精准。它已经成为基因组工程的有力工具。它在生命科学基础研究、生物技术和医药领域有广泛的应用前景。短短一两年，该技术成功应用于动植物及微生物的报道已屡见不鲜。在生物学基础研究领域，它有助于快速解析基因功能及基因间的相互作用；在生物技术领域，它有助于定向育种，有助于抗逆、高产或有特殊经济性状的作物或菌种的培育；在医药领域，利用它可以快速建立疾病模型，可以进行基因治疗和新药开发。CRISPR/Cas9的推广和应用步伐可谓一日千里。
