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二代测序技术在临床诊疗中的应用（一）

2021.6.23

Sanger测序在过去的二十年间是基因组研究的主流方法，取得了包括人类基因组计划(human genome project, HGP)等一系列重大成就，这使得单基因遗传病的鉴定和靶向治疗成为可能1,2。随着基因组大数据时代的到来，尽管Sanger测序是基因检测的金标准，但是NGS）技术应运而生，它能够在短时间内产生海量数据3,4，目前二代测序仪平台主要为Illumina和Thermo Scientific。Illumina公司测序仪采用边合成边测序的方法，基于可逆终止化学反应原理，检测测序时产生的荧光信号，而Thermo Scientific公司平台测序仪基于半导体测序原理，检测测序时产生的电信号。两种平台各有优缺点，在临床不同的需求中得到应用。

NGS已经应用于临床许多领域，在辅助生殖，如非侵入性产前检查（non-invasive prenatal test，NIPT）；遗传性疾病，如遗传性致病突变筛查；肿瘤研究，如早期诊断，用药指导，预后判断等中发挥着越来越重要的作用。柳叶刀发布的中国疾病负担研究显示，肿瘤和心血管疾病占比高且患病人群巨大，给家庭和国家造成了巨大的经济负担，急需新的检测手段精准指导临床诊疗5。此外，感染性疾病因病原体种类复杂并且传统方法鉴定周期长且困难，也急需高通量的检测方法。本文针对目前二代测序技术除了NIPT之外应用较为广泛的领域：肿瘤、心血管疾病和感染性疾病中应用进展进行了总结。

NGS可应用于全基因组测序（whole genome resequencing, WGS）和全外显子组测序（whole exome resequencing, WES），可获得点突变、小片段插入或缺失、拷贝数变异和结构变异的信息。全转录组测序方法（RNA-Seq）不仅可以检测基因表达谱，还可以检测可变剪接，RNA编辑和融合转录本。此外，可以使用包括染色质免疫沉淀测序、甲基化分析测序等方法研究表观遗传变异。同时研究人员利用强大的生物信息学工具，破译大量数据，以提高我们对疾病的理解，制定个性化的诊疗策略。

一

二代测序在肿瘤诊断中的应用

1.基于NGS进行多种癌种的研究：在过去的几年中，很多基于NGS的研究已经开展，以提供癌症的综合分子景观，识别有助于肿瘤发生，进展和转移的新的遗传改变，并研究肿瘤的复杂性、异质性和肿瘤的进化。在乳腺癌6-13，卵巢癌14，结直肠癌15,16，肺癌17，肝癌18，肾癌19，头颈部癌症20，黑色素瘤21，急性髓性白血病22,23等癌症中均取得了研究成果（表1）。

2.识别新的癌症相关基因：癌症主要由遗传突变的累积引起，遗传突变可以在胚系中遗传或在体细胞突变中获得。原癌基因、抑癌基因和DNA修复基因的改变使细胞逃避生长和调节控制机制，导至肿瘤的发生24。癌细胞也可能进一步突变，导至克隆性扩增25。随着克隆性扩增的发展，癌细胞最终会侵入其周围组织并转移到原发肿瘤的远端区域26。

癌症基因组的测序识别了很多新的癌症相关基因，特别是在乳腺癌中。有6篇文章报道了他们对大型乳腺癌数据的研究结果：TCGA（癌症和肿瘤基因图谱计划）对来自507名患者的510份样本进行了外显子组测序6，Banerji对103个样本进行外显子组测序，对46个样本进行了全基因组测序8，Stephens对100个样本进行了外显子组测序，Shah对65个样本进行全基因组/外显子组测序，对80个样本进行RNA测序12，Nik-Zaina对21个肿瘤/正常对照样本进行全基因组测序13。除了确认TP53，GATA3和PIK3CA中的频发性体细胞突变外，这些研究还发现了新的癌症相关突变。尽管新的突变发生频率低（<10%），但是特定基因的突变发生在乳腺癌的不同亚型中，并归属于不同的通路。例如，MAP3K1的突变经常发生在Luminal A型乳腺癌患者中6,8，涉及p53，染色质重塑和ERBB信号传导通路的基因在乳腺癌中突变频率较高12。此外，一些突变可以用作治疗位点，如GATA3的突变可能是芳香酶抑制剂疗效的阳性预测标记物8。

基因组的测序还有助于完善结直肠癌的突变谱。例如，对72对肿瘤/正常组织配对样本进行外显子组测序鉴定出36,303个导至蛋白变异的体细胞突变。对显著突变基因进一步分析归纳出23个候选的癌症基因，包括KRAS，TP53和PIK3CA，以及新的基因，例如调节细胞周期检查点的ATM。RNA测序鉴定了频发性的R-spondin融合，可能加强Wnt信号传导并诱导肿瘤发生16。另一项研究对224对肿瘤/正常组织进行外显子测序，该研究鉴定了超突变癌症中的15个高度突变的基因和非超突变癌症中的17个高度突变基因。在非超突变的癌症中，除了已知的APC，TP53和KRAS突变之外，还检测到SOX9，ARID1A，ATM和FAM123B中的新的频发突变。对SOX9，ARID1A，ATM和FAM123B的突变和功能作用的分析表明它们是高度潜在的结直肠癌相关基因。并发现非超突变的结肠癌和直肠癌在基因组变异中具有相似的模式。最后对97例肿瘤样本的全基因组测序识别了频发的NAV2-TCF7L1融合15。

3.深入揭示肿瘤的异质性和进化：使癌症成为一种难以治愈的疾病与每个克隆中选择和遗传不稳定性导至的肿瘤进化和异质性有很大关系27。这设想最初由Peter Nowell作为癌症的克隆进化模型于1976年提出，试图解释一段时间内肿瘤侵袭性的增加。其它研究人员在20世纪80年代研究了来自小鼠肉瘤细胞系的转移性亚克隆从而进一步支持了这一理论27。

NGS的广泛应用揭示了肿瘤异质性和肿瘤进化的机制。通过不同的形态学表型、表达谱和突变以及拷贝数变异，将肿瘤分成不同亚型28-31。在TCGA和Eillis的研究中发现mRNA表达亚型与体细胞突变有关6,8。NGS检测出的大量的体细胞突变展现出个体肿瘤的独特性，每个都包含不同的突变模式。例如Stephens在100位乳腺癌患者中发现73种不同的癌基因突变组合可能10。

肿瘤内异质性可以阐释为单个肿瘤内的非同一性细胞克隆或亚克隆，提示不同的组织学，基因表达，转移和增殖潜力。高灵敏度的优点使NGS成为研究肿瘤内异质性的有力工具。一项基于NGS的4例患者肾细胞癌研究成功地阐明了肿瘤内异质性19。对于患者1，在原发肿瘤的9个区域中发现的128个经验证的突变中，40个普遍存在，59个在一些区域共有，29个在特定区域是独有的，表明肿瘤异质性存在并且是“持续的区域克隆进化”19。最重要的是，该研究表明，单个肿瘤活检仅显示肿瘤突变的一小部分；单个活组织检查中，可检测到该肿瘤中所有突变的55%，并且大多数肿瘤区域约有34％的共有突变。

癌细胞的持续和平行进化可以建立和维持肿瘤内异质性。例如，在前列腺癌肿瘤细胞水平观察到显著的空间，细胞内和细胞间异质性。在不同患者中观察到单克隆起源和多克隆模型32。肾细胞癌研究中患者1和2中肿瘤区域的系统发育关系揭示了肿瘤的分支进化而非线性进化19。研究还显示了乳腺癌进化的分支结构27。根据“肿瘤生长的树干-分支模型” 27，促进肿瘤生长的体细胞突变，代表了肿瘤发展早期树的树干。这些体细胞突变很可能在这个阶段无处不在。随着时间的推移，其他被称为驱动因素的体细胞突变会导至肿瘤异质性发生，从而导至肿瘤和转移部位发生分支进化。之后，这些分支将进化并变得更加孤立，导至“瓶颈效应”，继而使得染色体更加不稳定，肿瘤异质性进一步扩大27。这致使肿瘤在不断变化的环境中产生适应和生存的能力，并影响药物治疗的疗效19。因此，重要的是检查肿瘤克隆结构并识别位于系统发育树的树干中的常见突变，这可能有助于理解靶向治疗抗性并发现更强大的治疗方法。

二代测序在肿瘤中的一些研究成果已经应用于临床，为患者早期筛查、预后判断和靶向用药提供了有力的证据。二代测序在肿瘤精准医学诊断中的应用专家共识也陆续出台33，随着二代测序技术的不断发展和对癌症研究的不断深入，二代测序技术将为癌症治疗的突破提供新的希望。

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