lncRNA MIR100HG和miR100以及miR125b在CRC抗cetuximab调控作用
lncRNA MIR100HG-derived miR-100 and miR-125b mediate cetuximab resistance via Wnt/β-catenin signaling
来源于lncRNA MIR100HG的miR-100和miR-125b通过Wnt/β-连环蛋白信号通路调控结直肠癌的抗西妥昔单抗效果
结直肠癌（colorectal cancer ,CRC）无论是在发病率还是在死亡率中都是最高的三类癌症之一[1]，早期结直肠患者没有症状，所以需要通过肠镜和基因筛查的方法去诊断。西妥昔单抗（cetuximab）和帕尼单抗是表皮生长因子受体（EGFR）单克隆抗体，能够结合细胞外EGFR区域增强受体的内吞和降解，一般可与化疗药物联用治疗CRC。患者对cetuximab治疗的耐药和KRAS、NRAS、BRAF、EGFR的基因突变可能有关，文章通过研究lncRNA MIR100HG和其包含的2个miRNA，miR-100和miR-125b,对CRC和头部颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系对cetuximab耐药机制的研究，发现miR-100和miR-125b都能下调5个负调控Wnt-β-catenin信号的分子，来促进Wnt信号通路，从而促进癌细胞的耐cetuximab性能。同时发现MIR100HG的表达能促进miR-125b的表达，miR-125b的表达能抑制GATA6的表达，而GATA6的表达又能抑制HIR100HG的表达，而MIR100HG的高表达与CRC病人的耐cetuxima过程有关。该研究为治疗和诊断结直肠癌的耐cetuxima提供一定的参考意义。
补充：约有17.5%的miRNA来源于lncRNA,定义为lnc-pri-miRNA，对这种miRNA的转录形成机制感兴趣的童鞋可以看这篇文献(Microprocessor mediates transcriptional termination in genes encoding long noncoding microRNAs)
这篇文章的主要研究结果如下
1. 建立了抗cetuximab的肿瘤细胞
1）作者团队选用KRAS/NRAS/BRAF基因未突变的微卫星不稳定的结直肠癌细胞，HCA-7，同时采用3维细胞培养技术来建立抗cetuximab（CTX）的结直肠癌细胞团（CC-CR）。一个简单抗CTX细胞系的构建就需要4个月，经历不少于20次2维细胞培养和3维加药细胞培养的循环，科研果然是寂寞的重复！
2）成功构建CC-CR后作者又通过一系类的验证来确定CC-CR的确是抗CTX。首先通过DIC（微分干涉对比显微镜）对比CC（对cetuximab敏感的结直肠癌细胞团）和CC-CR的形态差异，发现CC是中空的排列整齐的单细胞团，而CC-CR是实质紊乱的细胞团。其次是用CTX处理CC和CC-CR观察其克隆存活数和增殖、凋亡情况，发现CC在CTX的存在情况下克隆数大幅度下降、增殖抑制、凋亡细胞明显增多，而CC-CR基本没有差异。最后在动物实验上检测了CC异种移植瘤对CTX敏感，而CC-CR异种移植瘤无惧CTX依然保持着低分化和增殖特性。做科研就要从保持严谨的态度，多方面验证自己的结论，这样才会避免被撤稿危机。
2. 发现在抗cetuximab细胞中MIR100HG和来源于这个lncRNA的两个miR-100、miR-15b的表达上调
1） 作者是怎样发现长非编码RNA-MIR100HG和miR-100、miR-125b在抗cetuximab 结直肠癌细胞中高表达的呢？当然是我们永诺生物擅长做的基因测序！作者将3维培养的CC和CC-CR进行全外显子测序和RNA-Seq，没有发现与已知的抗cetuximab相关的基因，但是RNA-Seq发现大量差异表达的转录本。利用miRNA-Seq发现7个上调的miRNA和24个下调的miRNA。而且差异表达的转录本中lncRNA MIR100HG是上调最显著的，而差异表达的miRNA中上调最显著的是miR100和miR-125b。
2） 通过QPCR验证了MIR100HG和miR-100、miR-125b在CC-CR中高表达，同时利用TCGA数据库分析了MIT100HG的表达和miR-100、miR-125b的相关性，发现他们的确是有紧密联系。作者还利用FISH发现与CC异种异种移植瘤相比MIR100HG和miR-100、miR-125b在CC-CR异种移植瘤中富集。并分析其他30种CRC细胞系中MIR100HG和miR-100、miR-125b的表达情况，发现在抗cetuximab CRC细胞系中MIR100HG和miR-100、miR-125b的表达更高。
3） 作者还在8种头部颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系中检测了MIR100HG和miR-100、miR-125b的表达，发现抗cetuximab的NHSCC细胞系中MIR100HG和miR-100、miR-125b的表达上调。
3. MiR-100和miR-125b协同促进细胞的抗cetuximab
作者通过构建miR-100和miR-125b的过表达和干扰（sponge）慢病毒，构建稳定表达miR-100、miR-125b以及其sponge的CC、CC-CR细胞系。发现过表达CC或是干扰CC-CR的miR-100对的细胞的抗cetuximab能力没有miR-125b强。作者从3个方面进行了验证：1）CTX处理miRNA改变后CC和CC-CR检测其克隆的形成，2）检测增殖和凋亡，3）在裸鼠皮下种植异种瘤检测肿瘤大小。3个实验显示CC过表达miRNA后其抗cetuximab能力上升，而CC-CR过表达miRNA的sponge后其抗cetuximab的能力下降。作者同时还在其他结直肠癌细胞系和HNSCC细胞系中验证了miR-100和miR-125b协同促进细胞的抗cetuximab作用。
4. MiR-100和miR-125b通过抑制多个Wnt负调控因子增加Wnt信号
1） 作者通过分析上面mRNA测序数据发现在CC-CR里下调的基因有Wnt信号通路下调分子（DDK1和DDK3），而Wnt的活性在CC-CR里是激活的。作者猜想miR-100和miR-125b可能通过Wnt的下调分子来激活Wnt信号。利用生物信息学分析软件和网站作者发现DDK1的3’UTRs区有miR-100的结合位点，而DDK3的3’UTRs区有miR-125b的结合为点。作者还分析了Wnt的其他负调控分子ZNRF3、RNF43、APC2有miR-100和miR-125b的结合位点。然后通过构建这5个负调控分子的双荧光报告质粒，通过双荧光分析实验确认他们的确有相互作用位点。WB检测了CC过表达miRNA后这5个分子的表达下降和CC-CR干扰miRNA后这5个负调控分子的表达升高。
2） 随着Wnt负调控分子的表达降低，Wnt分子激活，在CC-CR中酪氨酸磷酸化的p-Y489β-catenin激活增加而且增加了核β-catenin，同时Wnt靶基因（CCND1、KLF4、MYC、NKD1、PROX1、S100A4）mRNA水平上升。CC过表达miRNA时Wnt的靶基因mRNA水平也随着上升，在其他结直肠癌细胞同样有这样的现象。
3） 用Wnt的负调控分子DDK1和DDK3的重组蛋白能恢复部分CC-CR的cetuximab的敏感性，使CC-CR的增殖降低、凋亡增加。同时利用Wnt的抑制剂XAV-939和ICG-001也能恢复CC-CR的cetuximab的敏感性，联合使用cetuximab和ICG-001能抑制CC-CR异种移植瘤的生长。
综上述，阻断Wnt信号，无论是APC/β-catenin上游还是下游，降解复合物能恢复抗cetuximab细胞的cetuximab的敏感性。
5. MIR100HG/miR-125b与GATA6是负调控关系
1）作者通过Match program软件分析MIR100HG的转录启动子2.5Kb区域能结合的转录因子，和RNA-seq结果进行比对，发现了转录因子GATA6既能结合MIR100HG的启动子区域又在CC-CR里表达下调。CC用cetuximab刺激后GATA6的表达下降，但是用cetuximab处理48h后GATA6的mRNA水平显著上升；CC里的GATA6敲除后MIR100HG表达上调，而且不再受cetuximab的调控，说明GATA6能有负调控MIR100HG。通过双荧光报告实验发现MIR100HG启动子活性受GATA6抑制，且程剂量依赖。
2） 作者进一步分析了GATA6与MIR100HG启动子结合的区域，在MIR100HG启动子区域预测了4个GATA结合位点，通过逐步截断和突变发现了GATA-binding site 2是GATA6抑制MIR100HG转录活性的主要位点。并通过CHIP和EMSA实验来证明GATA6和MIR100HG的GATA-binding site 2有结合。
3）通过分析发现GATA6的3’UTR区域有miR-125b的结合位点，通过双荧光报告系统检测到GATA6的确与miR-125b有结合。在CC里过表达miR-125b时GATA6的表达下降；而在CC-CR里干扰miR-125b时GATA6的表达上调。作者还在利用TCGA数据分析了CRC中GATA6和MIR100HG的相关性，发现在IV期CRC病人中GATA6是的低表达而MIR100HG是高表达。
总之，MIR100HG的转录受转录因子GATA6的抑制，但是miR-125b的高表达能抑制GATA6的表达，而MIT100HG高表达会促进miR-125b的表达，这三者之间形成了一个双反馈调节CC细胞的抗体cetuximab。
6. MIR100HG、miR100和miR125b在发展为抗cetuximab的结直肠癌中表达上调
作者最后利用临床数据分析了CRC病人在用cetuximab过程中miR-100、miR-125b等研究分子的改变，发现在cetuximab治疗后miR-100、miR-125b和核β-catenin的表达上调。GATA6与前期研究结果相反，在cetuximab治疗后同样是表达升高，且无论是miR-125b与GATA6还是miR-100与GATA6都没有负相关性。利用FISH检测CRC组织里miR-100、miR-125b、MIR100HG、β-catenin、GATA6的表达，发现与前期研究一致，都是在cetuximab治疗后miR-100、miR-125b、MIR100HG、β-catenin的表达上升，而GATA6的表达下降。
作者没有详细解释为什么出现GATA6与miR-125b的关系在统计10例CRC病人经过cetuximab治疗后表达没有成负相关结果。但是作者诚实的将这个结果呈现在文献里，说明出现相反的结果可以不用怀疑自己的结果，可能那就是真实的结果，要学会接受。
最后用一张作者补充数据的图来解释全部研究分子之间的关系：作者发现了非编码RNA MIR100HG以及其编码的2个miRNA参与调控Wnt信号通路激活引起的抗cetuximab效应。
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