空间转录组测序样本准备指南
现有空间转录组研究平台是基于冰冻样本进行研究，所以在样本冻存前至少10分钟，将异戊烷和液氮浴准备好（之所以用异戊烷而不直接用液氮进行速冻，是因为液氮沸点比较低，直接液氮处理可能在沸腾过程中使组织周围形成空穴，导致不同区域降温不同步而改变内部形态，甚至组织碎裂）。然后用镊子或者刮刀将新鲜组织转移到异戊烷中，使组织完全浸没且浸泡至少1分钟。冷冻后，可用镊子或者刮刀将组织转移到密封的预冷容器或者冻存管中，-80℃储存，或者进行OCT包埋。
1.组织样本选择
空间转录组研究的特点是基于空间物理位置的转录组学研究，所以组织样本的选择是该研究的前提条件。由于空间转录组捕获芯片的限制（6.5mmX6.5mm），组织样本最后上芯片的切片不能超过该面积范围。因此，在选择实验样本前，需要对进行研究的样本进行预实验。通过前期组织学检测，确认好样本的最佳取材位置，最合理组织大小。如果本身样本使较大的组织，可以在后续OCT包埋、切片过程中被分割（1mm切口的预冷刀片），避免深切口损伤组织。
2.新鲜样本处理
空间转录组是针对转录组学的检测，因此，新鲜样本是保证RNA完整性的前提（后续RNA
RIN值＞7）。将新鲜组织样本取下后迅速用预冷的PBC溶液或者生理盐水冲洗组织表面残留，然后用干净的纱布或吸水纸吸干液体（防止其他体液在组织表面形成冰晶，影响OCT包埋效果）。
图1 组织冷冻与包埋过程
3.样本冻存
现有空间转录组研究平台是基于冰冻样本进行研究，所以在样本冻存前至少10分钟，将异戊烷和液氮浴准备好（之所以用异戊烷而不直接用液氮进行速冻，是因为液氮沸点比较低，直接液氮处理可能在沸腾过程中使组织周围形成空穴，导致不同区域降温不同步而改变内部形态，甚至组织碎裂）。然后用镊子或者刮刀将新鲜组织转移到异戊烷中，使组织完全浸没且侵泡至少1分钟。冷冻后，可用镊子或者刮刀将组织转移到密封的预冷容器或者冻存管中，-80℃储存，或者进行OCT包埋。
4.OCT包埋
OCT包埋是用来为后续切片制作做准备。将预冷好的OCT填充入冷冻模具的底部（可做好标记，以确认组织方向），然后用镊子迅速将冰冻好的组织放入，并用OCT覆盖组织，使之完全包埋住。该过程应避免产生气泡。然后立即将冷冻磨具转移到碎干冰上。当OCT变得完全不透明，包埋成功。当然，作为强迫症的你，也可以对组织进行修理，去掉多余部分，留下需要的组织块。最后，包埋好的组织块可进行干冰上运输至-80°C进行储存。
图2 OCT包埋前后
5.切片制备
如果老师做好冰冻组织包埋工作了，如果没有后续切片设备进行切片制备，可以直接将样本给我们，我们来进行后续的工作及空间转录组测序实验。如果实验室有设备，可自行进行切片制备及相关组织学检测。以现有研究测试样本情况来看，大部分的样本切片厚度保持在10-20um之间为宜。另外，制备好的冰冻切片尽量在一周内送至公司进行后续实验。我们会取OCT包埋样本的10张切片，用核酸试剂盒抽提RNA并通过RIN评估制备样本的质量；RIN>7的样本，建议做下游组织优化的实验。
以上5个实验步骤为空间转录组测序检测前的样本准备过程。
