斑点杂交技术的方法和步骤
斑点杂交是指将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上,然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。同一种样品经不同倍数的稀释,还可以得到半定量的结果。所以它是一种简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因诊断中经常用到,是研究基因表达的有力工具。但由于目的序列未与非目的序列分离,不能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时,难以区分目的序列信号和干扰信号。
1、材料：待分析的DNA或RNA样品，已标记的探针。
2、设备：狭槽点样器，真空泵，恒温水浴，真空烤箱等。
3、试剂：
（1）100% 甲酰胺。
（2）甲醛(37%)。
（3） 20×SSC。
（4）0.1mol/L NaOH。
（5）硝酸纤维素滤膜。
（6）滤纸。
4、操作步骤：
(1) 10μl样品与20μl 100%甲酰胺、 7μl 37%甲醛、2μl 20×SSC混合。混合置于68℃，15分钟后置冰浴中。
(2) 用0.1mol/L NaOH清洗点样器,再用无菌水充分冲洗。将一张经20×SSC浸润的滤纸铺在点样器上,上面再铺上一张经20×SSC浸润1小时的硝酸纤维素滤膜，加盖并夹紧，接通真空泵。
(3) 用10×SSC清洗各样孔。在每一样品中加两倍体积的2×SSC,混合后加样于孔中。外围几个孔中加2μl染料定位,缓慢抽吸。每孔用1ml 10×SSC清洗两次。继续抽吸5分钟,吸干滤膜。
(4) 取出滤膜,夹在两张滤纸中间, 80℃真空烘干2小时。按上述Southern或Norhtern杂交所述的方法与放射性标记探针杂交。
[注意]
1、在放射自显影时应注意滤膜必须干燥，并覆盖上保鲜膜，否则，滤膜将与X-光片粘在一起，使以后的操作困难。
2、在杂交过程中，整个滤膜应一直是湿润的，不得干涸。
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