Northern杂交步骤和过程
Northern杂交与Southern杂交很相似。主要区别是被检测对象为RNA,其电泳在变性条件下进行,以去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。变性电泳主要有3种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。
1、材料：待检测的RNA及制备好的探针。
2、设备：电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X-光片，杂交袋，硝酸纤维素膜或尼龙膜。
3、试剂：
(1)20×SSPE:175.3g NaCl, 88.2g柠檬酸钠，溶于800ml水中，用10mol/LNaOH调pH至7.4，定溶到1L。
(2)其他试剂：与Southern杂交试剂类似，只是所有的试剂均应用DEPC处理。
4、操作步骤：
(1)RNA经变性电泳完毕后,可立即将乙醛酰RNA转移至硝酸纤维素滤膜上。转移方法与转移DNA的方法相似。
(2)转移完毕后 ,以6×SSC溶液于室温浸泡此膜5分钟,以除去琼脂糖碎片。
(3)将该杂交膜夹于两张滤纸中间,用真空烤箱于80℃干燥0.5-2小时。
(4) 用下列两种溶液之一进行预杂交，时间为1-2小时。若于42℃进行,应采用: 50%甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt's试剂，0.1% SDS；若于68℃进行,应采用:6×SSC，2×Denhardt's试剂，0.1% SDS，（注意：BLOTTO不能用于Northern杂交）。
(5) 在预杂交液中加入变性的放射性标记探针,如欲检测低丰度mRNA,所用探针的量至少为0.1μg,其放射性比活度应大于2×108 cpm/分·μg,放在适宜的温度条件下杂交16-24小时。
(6) 用1×SSC、0.1% SDS于室温洗膜20分钟,随后用0.2×SSC、0.1% SDS于68℃洗膜3次,每次20分钟。
(7) 用X光片(Kodak XAR-2或与之相当的产品)进行放射自显影,附加增感屏于-70℃曝光24-48小时。
[注意]
(1)如果琼脂糖浓度高于1%，或凝胶厚度大于0.5cm，或待分析的RNA大于2.5kb,需用0.05mol/LNaOH浸泡凝胶20分钟,部分水解RNA并提高转移效率。浸泡后用经DEPC处理的水淋洗凝胶,并用20×SSC浸泡凝胶45分钟。然后再转移到滤膜上。
(2)在步骤(3)的操作中，如果滤膜上含有乙醛酰RNA,杂交前需用20mmol/L Tris·Cl (pH8.0)于65℃洗膜,以除去RNA上的乙二醛分子。
(3)RNA自凝胶转移至尼龙膜所用方法，与RNA转移至硝酸纤维素滤膜所用方法类似。
(4)含甲醛的凝胶在RNA转移前需用经DEPC处理的水淋洗数次,以除去甲醛。当使用尼龙膜杂交时注意，有些带正电荷的尼龙膜在碱性溶液中具有固着核酸的能力，需用7.5mmol/LNaOH溶液洗脱琼脂糖中的乙醛酰RNA，同时可部分水解RNA，并提高较长RNA分子(>2.3kb)转移的速度和效率。此外，碱可以除去mRNA分子的乙二醛加合物,免去固定后洗脱的步骤。乙醛酰RNA在碱性条件下转移至带正电荷尼龙膜的操作也按DNA转移的方法进行，但转移缓冲液为7.5mmol/LNaOH，转移结束后(4.5-6.0小时)，尼龙膜需用2×SSC、0.1%SDS淋洗片刻、于室温晾干。
(5)尼龙膜的不足之处是背景较高,用RNA探针时尤为严重。将滤膜长时间置于高浓度的碱性溶液中,会导致杂交背景明显升高,可通过提高预杂交和杂交步骤中有关阻断试剂的量来予以解决。
(6)如用中性缓冲液进行RNA转移,转移结束后,将晾干的尼龙膜夹在两张滤纸中间,80℃干烤0.5-2小时,或者254nm波长的紫外线照射尼龙膜带RNA的一面。后一种方法较为繁琐,但却优先使用,因为某些批号的带正电荷的尼龙膜经此处理后,杂交信号可以增强。然而为获得最佳效果,务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构,而过度照射却使RNA上一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面,导致杂交信号减弱。
