苏州医工所在基于铜纳米簇的酶活性检测研究中取得进展
近年来，一种新兴的纳米材料金属纳米簇逐渐成为生物传感与生物成像等领域的研究热点。金属纳米簇通常是由两个至几十个原子构成的纳米颗粒，尺寸一般不超过2nm，介于金属原子和纳米颗粒之间。金属纳米簇具有特殊尺寸，因此连续电子能级会分裂成离散能级使其具有特殊的光学以及电学性质。目前常用的金属纳米簇主要包括金纳米簇、银纳米簇以及铜纳米簇，其中铜纳米簇比金、银纳米簇具备更多的优点，如成本极低、生物安全性高及反应条件更加接近生理环境等。因此，铜纳米簇作为一种新型纳米探针在金属离子、生物小分子、蛋白质、核酸、酶的分析检测以及细胞成像等领域具有广阔应用前景。
近日，中国科学院苏州生物医学工程技术研究所医学检验室的杨大威等科研人员以DNA为模板、硫酸铜为原料、抗坏血酸为还原剂合成了铜纳米簇，并基于该铜纳米簇分别实现了碱性磷酸酶及核酸内切酶的活性检测。
碱性磷酸酶是一种广泛分布在生物膜上的酶，可以催化核酸、蛋白质等分子脱掉磷酸基团。碱性磷酸酶可以参与信号传导、细胞生长及凋亡等过程，同时可以作为肝炎、前列腺癌及骨癌的诊断标记分子。因此，实现碱性磷酸酶活性的超灵敏检测在基础生物学研究及临床诊断方面均有重要意义。目前碱性磷酸酶活性检测的主要方法为比色法、电化学法及表面增强拉曼光谱法，这些方法均需要专业的设备，且灵敏度较低。发展成本低廉、操作简单、灵敏度高的碱性磷酸酶显得尤为重要。苏州医工所科研人员首先基于合成的铜纳米簇的荧光特性，实现了碱性磷酸酶活性的灵敏检测。在这一工作中，碱性磷酸酶的存在，可以将无还原性的磷酸-抗坏血酸水解为具有还原性的抗坏血酸，进而将Cu2+还原为Cu+，继而触发“点击化学”反应，生成长链DNA，以此为模板合成铜纳米簇，通过检测铜纳米簇的荧光信号实现碱性磷酸酶的超灵敏检测。该检测体系的检测范围为0.1-40U/mL，检测限为0.05U/mL。
EcoRI核酸内切酶是一种常用的限制性核酸内切酶，可以识别特殊的核酸位点，剪切磷酸二酯键。核酸内切酶作为一种重要的工具酶，可广泛参与DNA复制、重组，分子克隆以及基因编辑等过程中。因此实现核酸内切酶活性的检测在基础分子生物学研究及临床诊断方面均具有重要的意义。目前核酸内切酶活性检测常用的方法包括凝胶电泳法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、比色法以及电化学发光法，然而这些方法均具有操作复杂、原料昂贵以及灵敏度低等缺点。因此设计简单易行、灵敏度高的核酸内切酶活性检测方法尤为必要。苏州医工所科研人员以双链DNA为模板合成的铜纳米簇作为电信号探针，用电化学手段实现了核酸内切酶活性的灵敏检测。在这一工作中，首先将双链DNA修饰在金电极上，当核酸内切酶不存在时，以金电极上的双链DNA为模板可以合成铜纳米簇，铜纳米簇可以溶解沉积到玻碳电极上，进而可以检测其电化学信号。当核酸内切酶存在时，其可以识别和剪切电极表面上的双链DNA，电极表面铜纳米簇不能生成，即不能检测到电化学信号。因此，在这一检测方法中可以通过检测电化学信号的强弱实现核酸内切酶活性的检测，该检测体系的检测范围为10-3-10 U/mL，检测限为10-3U/mL。
图1.A，铜纳米簇荧光发射光谱（碱性磷酸酶浓度: 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、20、40U/mL）；B，碱性磷酸酶活性检测标准曲线；C，检测体系的特异性验证；D，矾酸钠对碱性磷酸酶活性的抑制效应。
图2.A，核酸内切酶作用前后电泳图及DNA不同修饰阶段电化学阻抗图；B，加入核酸内切酶前后的循环伏安图（核酸内切酶存在a、核酸内切酶不存在b）；C，差分脉冲伏安曲线（核酸内切酶浓度：10−3、5×10−3、10−2、5×10−2、10−1、5×10−1、1、5、10、50U/mL从下到上)；D，核酸内切酶检测标准曲线。
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