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RNA在脊椎动物胚胎和器官中整体标本原位杂交检测实验3

2019.3.27

非洲爪蟾的整体原位

实验材料	非洲白化爪蟾的胚胎
试剂、试剂盒	2% (m V)半胱氨酸 pH 7.8 MEMPFA缓冲液 PBS 50%75%甲醇灭菌水 100%甲醇 25% 甲醇 PBT PBT ： PBS 中加 0.1% (V V) Tween-20 pH 7.8 PBT中加0.1 mol L三乙醇胺（TEA)缓冲液 pH 7.8 (未使用PBT时）新鲜配置乙酐预杂交溶液B 杂交溶液B:预杂交溶液B中加入1μg ml地高辛标记的核酸探针
仪器、耗材	5 ml螺旋盖玻璃小瓶（Fisher)玻璃针 37℃和60℃带摇床的水浴
实验步骤	1) 在2%半胱氨酸，pH 7.8的溶液中培养非洲白化爪蟾的胚胎3〜10 min以除去胚胎外的胨胶层。 2) 将胚胎转移到5 ml螺旋盖玻璃小瓶中，等胚胎沉淀后，移去大部分的液体，并向小瓶中加入MEMPFA缓冲液。室温下培养30 min并轻轻摇晃以固定胚胎。 3) 用PBS取代MEMPFA缓冲液室温下洗3次，每次30 min。 4) 依次用50%、70%和100%甲醇室温下使样本脱水，每种溶液浸泡10 min。 5) 室温下用100%甲醇洗3次，每次10 min。-20℃保存。 6) 依次加入1 ml的75%、50%和25%甲醇/PBT,室温温育5min，使样本再水化。 7) 室温下用PBT洗3次，每次5 min。使用玻璃针将胚腔刺破。 8) 用 500μL PBT 中加 0.1 mol/L TEA 缓冲液，pH 7.8 洗 2 次，每次 5 min。 9) 加入1. 25μL乙酐。室温下摇动试管5 min,再加入1.25μL乙酐，再摇5 min。 10) 1 ml PBT溶液洗2次，每次5 min。 11) 室温下再用新鲜加入的1 ml PBT和250μL杂交溶液B洗10 min。 12) —旦胚胎在溶液中沉下，用500μL新鲜的预杂交溶液B预杂交：在60℃摇晃的水浴中孵育10 min。 13) 换成500μL新的预杂交溶液B，60〜65℃预杂交5 h以上。 14) 用加有1μg/ml地高辛标记探针的500μL杂交溶液B，60〜65℃杂交过夜。 15) 接下来用酶探测RNA杂交物收起
注意事项	所有的溶液都要经过DEPC处理或者高压灭菌以抑制RNA酶活性。样本干燥会导致背景的增强，整个过程中样本都要有液体覆盖以避免干燥。因此，换液时始终保持样本上覆盖一定量的液体。这样做同样可以避免物理损坏或者丢失样本。在固定步骤中保持胚胎处于悬浮状态是很重要的，因为不这样做样本就会变平。如果同时需要分析很多胚胎，则需荽使用一个较大的容器（如一个大闪烁管）以避免胚胎聚集成块