酶标仪在植物领域的三种应用总结（三）
3.3 ROS 分析
与氧化应激密切相关的活性氧簇 (Reactive Oxygen Species，ROS) 在植物免疫信号通路中发挥着关键的作用，也是常规检 测的信号事件之一。与哺乳动物细胞的 ROS 水平检测不同，植物 ROS 信号通常用基于化学发光的鲁米诺 (Luminol) 法。Luminol 在氧化环境下 ( 如结合 H2O2 )，结合合适的催化物就会产光 ( 图十一 )，因此可用于动态追踪 ROS 的水平，例如探究不同 表达条件下和突变情况下植物在鞭毛蛋白 flg22 刺激下的 ROS 反应程度 ( 图十二，Cell Host Microbe. 2014 Oct 8;16(4):48494. ；Mol Cell.2018 Feb 1;69(3):493-504.e6. )。
图十一 Luminol 工作原理，图片来源于网址：https://www.aimsci.com/ros/html/?page_id=285
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图十二 左，利用 Luminol 法检测 avrB 的表达对 Flg22 刺激的 ROS 水平的影响，图片来源于：Cell Host Microbe. 2014 Oct 8;16 (4):484-94.，酶标仪为 SpectraMax L。右，研究突变体对 Flg22 刺激的 ROS 水平的影响，图片来源于：Mol Cell.2018 Feb 1;69 (3):493-504.e6.，酶标仪为具有化学发光检测能力的 SpectraMax 系列。
由于 Luminol 反应为快速化学反应体系，因此需要酶标仪配备注射器系统，如 Molecular Devices 的 SpectraMax L， SpectraMax i3x 等 ( 图十三 )。除了 luminol 法之外，结合试剂盒还可通过光吸收法和荧光法进行植物组织的 H2O2 定量 ( 图十四， Mol Plant. 2013 Mar;6(2):337-49. )。
图十三 Luminol 法结果示意图，数据基于配备注射器的 SpectraMax L，应用快速动力学模式，采样间隔 1 秒。 图片来源于文献：Mol Plant. 2013 Mar;6(2):337-49.。酶标仪为SpectraMax Gemini。
图十四 基于荧光法 H2O2 定量，分析基因过表达对 H2O2 的影响。
3.4 基于水母素 (Aequorin) 的钙信号分析
在哺乳动物和人类细胞中，钙离子调控几乎参与了所有核心的细胞信号事件和行为事件，其和磷酸化调控被誉为统治级别的 信号转导方式。在植物中也不例外，钙信号是核心的植物生长和发育的调控者，参与了细胞分裂，激素的下游通路和应激反应等 等 (Plant Cell. 2005 Aug;17(8):2142-55.)。在哺乳动物细胞研究中，钙流通常是基于荧光探针法，然而，在植物中存在多种色素 和自发荧光物质的干扰，因此相关研究会主要基于 Aequorin 法，其主要基于使用过表达的 Aequorin 蛋白。通过三个高亲和力位 点结合钙离子后，在氧的作用下 Aequorin 会不可逆催化 coelenterazine 发出蓝光 ( 图十五，Methods Mol Biol. 2013;1043:4554. )。该反应属于化学发光，可用支持对应检测模式的酶标仪进行分析。
图十五 利用 Aequorin 检测钙流原理图，图片来源于文献：Methods Mol Biol. 2013;1043:45-54.
由于钙离子流动是快反应，因此针对的检测模式为化学发光快速动力学检测，因此仪器需有配备有注射器和化学发光检测能 力，如Flexstation 3，SpectraMax i3x和SpectraMax L等 (图十六)。
图十六 上图，Aequorin 法检测植物钙流结果示意图，数据来源于配备注射器的 SpectraMax i3x。下图，利 用 Aequorin 法检测基因突变对 glutamate 刺激的钙流的影响，突变来源文献：J Exp Bot. 2016 Mar;67 (6):1853-69.。酶标仪为 Flexstation 3
与常见的荧光法不同，Aequorin 本质为化学发光法，因此避免了由激发光带来的光损伤影响，同时也不受化合物自发荧光的影 响，具有更低的背景等优势。
四、利用酶标仪进行植物-微生物相互作用分析
在最后一章中，我们会涉及到植物整体水平的分析，主要关注近几年兴起的植物-微生物相互作用分析。我们会通过两个案 例向大家介绍酶标仪在这个方向的应用。
第一个案例关注植物，如拟南芥与在植物根上常见的微生物如荧光假单胞菌之间的共生关系。为了确认植物来源的变化是否 会影响共生微生物的适应能力，科学家建立基于 24 孔板的高通量筛选系统 ( Rhizosphere assay 图十七，Nat Plants. 2015;1 (6). )。在体系中，通过水培将拟南芥种在 24 孔板中的漂浮网盘上，这样只有根浸入培养基中。再引入标记了 GFP 的细菌，就可 以使用酶标仪进行高通量的微生物增殖分析了( 图十七 )。由于体系培养基中无碳，因此微生物的增殖需要依靠植物本身的光合产 物。
图十七 上图，Rhizosphere assay 示意图。左边放大图可观察拟南芥种于漂浮网盘上，右图为引入微生物 P. fluorescens 7 天后的照片。 下图，基于 Rhizosphere assay 筛选 196 株拟南芥的结果。图片来源于文献：Nat Plants. 2015;1(6).。酶标仪为 SpectraMax M3。
第二个案例同样基于 GFP 蛋白的荧光检测，但是基于检测真菌对植物的侵染机制。一些真菌的效应蛋白，如大豆疫霉菌的 Avr1b 蛋白可直接将 GFP 蛋白转入至植物细胞中，这样就可以通过酶标仪分析靶细胞的荧光检测霉菌的感染能力和进一步机制研 究 ( 图十八，Cell. 2010 Jul 23;142(2):284-95. )。在此，为了获得更具有代表性的荧光信号，我们可使用 Molecular Devices 具有 孔扫描功能的酶标仪进行多点信号的采集和平均。
图十八 基于荧光法动态分析 A549 细胞对霉菌效应蛋白的摄入。 图片来源于文献：Cell. 2010 Jul 23;142(2):284-95. 。酶标仪为 SpectraMax Gemini。
五、总结
上述的案例向我们展示了一些酶标仪在植物领域常见的应用方向。从常规的分子分析、酶活检测到植物信号的研究等，都可 以应用酶标仪进检测和分析，在提高通量的同时简化实验的流程。
针对植物领域 Molecular Devices 提供了包括硬件和软件的解决方案。对于常见的光吸收实验，如紫外法核酸蛋白定量和光 吸收酶活、ELISA 等，我们推荐配备比色皿端口的全波长光吸收酶标仪 SpectraMax Plus 384，其配备了 8 套检测光路，适合于 高通量光吸收分析。针对荧光检测，如报告基因和酶活，推荐灵敏的 SepctraMax Gemini 荧光酶标仪。而针对化学发光检测，如 报告基因，ROS 检测，则推荐具有高达9个动态检测数量级的 SpectraMax L，其能配备注射器体系，适用于各种快/慢反应的检 测。除了单功能外，我们也有支持多个功能检测的酶标仪平台，如经典的M系列和新推出的 iD 系列可供选择。
在软件上，业内领先的 SoftMax Pro 软件可轻松应对检测过程中涉及的分析需求。对于常见的曲线拟合，SoftMax Pro 7 提 供了多达 21 中拟合选择，并且拟合的方式全部可以自定义，因此可用于多种酶活分析等。对于动力学检测，SoftMax Pro 可自动 按需求输出斜率、AUC、最高速度等等。对于光谱扫描，SoftMax Pro 则可自动导出最高吸收峰波长等。只需点击一次，数据采 集到分析到输出就可一次完成。
