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细胞膜完整性及膜转运功能检测实验—膜联蛋白 V 染色法

2019.4.05

实验方法原理	细胞凋亡时，其细胞膜上的磷脂分布发生改变，尤其是凋亡早期，细胞膜上的磷脂酰胆碱暴露出来，由于 PS（磷脂酰丝氨酸）外膜化比凋亡引起的核酸变化更早期，成为细胞凋亡的早期指征之一。抗凝剂膜联蛋白 V 具有与带负电荷的磷脂酰胆碱结合的特性，因此可采用荧光素标记的膜联蛋白 V 和 PI 同时染色来检测早期凋亡细胞。也可采用 IHC 方法迸行鉴别。
实验步骤	1. 主要试剂的配制染色缓冲液：10 mmol/L HEPES-NaOH，pH7.4；140 mmol/L NaCl；2.5 mmol/LCaCl2。 FITC-膜联蛋白 V 染色液：结合有FITC-膜联蛋白 V 按 1.0 mg/ml 溶于染色缓冲液中（新鲜配制）。 PI（Sigma，MO，USA）保存液： 1 mg/ml的水溶液，于 4℃ 避光保存。 2. 操作流程 2.1 （0.1～1）×10⁶ 细胞离心（3000 r/min）去上清后，重新悬浮于 1 ml 的膜联蛋白 V-FITC 染色液中，室温下染色 5 min。 2.2 在细胞悬液中加入 10 μl 的 PI保存液，室温下染色5 min 后上机检测。 2.3 流式细胞仪检测采用蓝色激发光（波长为 488 nm 的氩离子激光），绿色荧光检测范围为（530 士 20）nm，红色荧光检测范围为〉600 nm。 3. 结果观察正常活细胞不被着色，仅具有背景染色；早期凋亡细胞膜与膜联蛋白 V-FITC 结合而显示出绿色荧光，但不被 PI 着色，所以无红色荧光；晚期凋亡细胞或坏死细胞则同时显示出强的绿色和红色荧光。展开

实验方法原理

细胞凋亡时，其细胞膜上的磷脂分布发生改变，尤其是凋亡早期，细胞膜上的磷脂酰胆碱暴露出来，由于 PS（磷脂酰丝氨酸）外膜化比凋亡引起的核酸变化更早期，成为细胞凋亡的早期指征之一。抗凝剂膜联蛋白 V 具有与带负电荷的磷脂酰胆碱结合的特性，因此可采用荧光素标记的膜联蛋白 V 和 PI 同时染色来检测早期凋亡细胞。也可采用 IHC 方法迸行鉴别。

实验步骤

1. 主要试剂的配制

染色缓冲液：10 mmol/L HEPES-NaOH，pH7.4；140 mmol/L NaCl；2.5 mmol/LCaCl2。

FITC-膜联蛋白 V 染色液：结合有FITC-膜联蛋白 V 按 1.0 mg/ml 溶于染色缓冲液中（新鲜配制）。

PI（Sigma，MO，USA）保存液： 1 mg/ml的水溶液，于 4℃ 避光保存。

2. 操作流程

2.1 （0.1～1）×10⁶ 细胞离心（3000 r/min）去上清后，重新悬浮于 1 ml 的膜联蛋白 V-FITC 染色液中，室温下染色 5 min。

2.2 在细胞悬液中加入 10 μl 的 PI保存液，室温下染色5 min 后上机检测。

2.3 流式细胞仪检测采用蓝色激发光（波长为 488 nm 的氩离子激光），绿色荧光检测范围为（530 士 20）nm，红色荧光检测范围为〉600 nm。

3. 结果观察

正常活细胞不被着色，仅具有背景染色；早期凋亡细胞膜与膜联蛋白 V-FITC 结合而显示出绿色荧光，但不被 PI 着色，所以无红色荧光；晚期凋亡细胞或坏死细胞则同时显示出强的绿色和红色荧光。

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