实验小鼠肺部炎症的局部免疫疗法
实验概要
局部肺部疾病，如哮喘，慢性阻塞性肺病或肺癌的免疫疗法的创新要求肺部目标细胞有一个完善的交付途径。一个重要途径是通过直接滴入到呼吸道而不是通过消化道。本试验详细的介绍了抗体获得，重组细胞因子，抑制小分子和其他分子疗法，以有效诱导和保护呼吸道的免疫反应。动物在可吸入麻醉下提供治疗，将溶液滴入小鼠的鼻孔，在5分钟内完成整个过程。物质进入肺部，以确保正确的传递，它可以用荧光染料标记，在肺部监测。此外，可以应用荧光标记抗原，可视化靶细胞抗原在体内的变化。
主要试剂
异氟醚(Forene®，Abbott GmbH，Wiesbaden，Germany，4831867)
氧(Conoxia® GO2X，Linde AG，Unterschleißheim，Germany，cat. no.: 2020101)
磷酸盐缓冲液(PBS)，无钙或镁(Gibco-Invitrogen，Life Technologies，Darmstadt，Germany，cat. no. 14190)
替代麻醉剂I：Avertin
1) 封闭液：10毫升T-戊醇(2 -甲基-2 -丁醇，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Munich，Germany，cat. no. 152463)和10 g 2 2，2 -三溴-甲醇(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Munich，Germany，cat. no. T48402)
工作溶液：2.5％
2) 0.25毫升封闭液和9.75毫升PBS
3) 涡旋10分钟。使用前3个小时内准备，保存于4°C
4) 剂量：15-17微克/克(腹腔注射50-70μL，取决于重量)
替代麻醉II：氯胺酮(Ratiopharm GmbH，Ulm，Germany；封闭液：50毫克/毫升；终浓度为12毫克/毫升)，Xylazin((Rompun®腹腔注射液2％， Bayer Animal Health GmbH，Leverkusen，Germany，终浓度：1.6毫克/毫升)无菌PBS ；氯胺酮和二甲苯胺噻嗪用PBS混合，并保存于4°C，腹腔注射80-100μl，不建议这两种麻醉药(替代I和II)。卵清蛋白：白蛋白，鸡蛋， 5X的结晶(Calbiochem，Merck KGaA，Darmstadt，Germany，cat. no. 32467 )
OVA-Texas Red(Invitrogen，Darmstadt，Germany，cat. no.: O23021)
台盼蓝(Biochrome AG，Berlin，Germany，cat. no.: L 6323)
DAPI ×2盐酸(4’，6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，Life Technologies，Darmstadt，Germany，cat. no. D1306)
主要设备
1.5毫升的Eppendorf管，蒸压(Eppendorf AG，Hamburg，Germany，cat.no.0030 120.086)
200μL枪头，蒸压(Starlab GmbH，Ahrensburg，Germany，cat. no. S1111-1006)
异氟醚输送系统连接到氧气(Eickemeyer Medizintechnik für Tierärzte KG，Tuttlingen，Germany)
实验材料
不同的实验方案选择不同的小鼠品系。过敏性哮喘模型，我们选择BALB / c小鼠，因为它们有一个Th2型的遗传背景。基因敲出分析出具有其他遗传背景的可能性，也引起哮喘的特点(AHR的，炎症，生产粘液等)。
实验步骤
要根据试剂盒的指示，配置试剂保存于4°C或-20°C。注意：稀释试剂应保存在无菌条件下，以排除可能的污染。试剂如果有需要的应进行过滤分装。
程序
专栏1：发生哮喘小鼠的治疗。
将小鼠分为不同的组，分装于不同的笼子。对哮喘治疗组和模型组在0和7天腹腔注射200μl OVA（卵）和明矾的混合物（卵/明矾）。对照组，在同一时间点用PBS与明矾的混合物。致敏后八天，在25，26和27天小鼠注射 25-50μL卵 （哮喘模型组和治疗组）或PBS（对照组） 。此外治疗组也可以在产生过敏原前（25-27天）注射 25-50μL 指示治疗（如IL-6R）30分钟到2小时。到28天对支气管肺泡灌洗液和肺细胞悬液测量AHR。
注意：卵 /明矾混合液的准备：称量5毫克卵清蛋白溶于10毫升0.9％氯化钠，1g铝硫酸钾（注：明矾）溶于10毫升蒸馏水。然后吸取明矾到卵清蛋白溶液中加入NaOH调整pH值至6.5。然后放于室温孵育1小时，轻轻摇动。4°C离心1500转/5分钟，弃上清。加入Aqua dest 10毫升悬浮卵 /明矾溶液。卵 /明矾溶液应在当天使用或4°C储存第二天使用。
在将溶液应用于小鼠实验之前，应进行体外细胞培养实验，检查其效率。
1. 将试剂稀释到适当浓度并置于冰上。
2. 将小鼠放于麻醉设备的鼠盒中，用异氟醚麻醉30秒只1分钟。
关键的一步：根据指示用麻醉设配、以避免伤害到小鼠。当小鼠不动了尽快将其移除鼠盒，此时小鼠的呼吸已略有放缓。把握时间是很重要的，是试剂成功应用于小鼠的关键。如果鼠麻醉不够深，小鼠苏醒会导致试剂的浪费，和不完整的生理作用。
3. 吸取25-50微升溶液。关键的一步：不要使用超过50μL滴鼻应用，因为这将降低吸收的效率和对鼠标有危险。
4. 将鼠移除鼠盒后，并保持它的脖子，头部稳定。用手固定尾巴。头部微微向后弯曲，保持呼吸道通畅，消除呼吸道阻塞。
5. 立即将吸取的溶液，仔细缓慢的滴入到鼻子。把鼠放回入笼内。
注意：确保小鼠处于清醒状态。
6. 实验完成后，处死小鼠取出肺，如Sauer et al. and Maxeiner et al 等方法进行分析。也可以来衡量呼吸道呼吸速率和采取血液样本，以及进行支气管肺泡灌洗等进行分析。
