小鼠组织切片免疫组化实验步骤
实验概要
免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
实验材料
二甲苯
酒精（100％，95％）
EDTA抗原修复工作液（pH8.0，稀释50倍使用）
0.5M Tris-NaCl (TBS) pH7.4（稀释10倍使用）
DAB显色液（临用前配制：试剂盒A、B、C各50ul，于1ml水中混匀）
实验步骤
1. 石蜡切片置60℃烘箱中烘烤过夜
2. 二甲苯中脱蜡，梯度酒精入水(无水乙醇，95％酒精)，浸泡于蒸馏水中待用
3. 抗原修复
取500mlEDTA抗原修复工作液于1000ml烧杯中，在小功率电炉上加热，至似沸微沸（为了防止脱片）。将组织切片缓慢放入烧杯。继续加热，保持液体在微沸状态20分钟。将烧杯移开火源，室温下自然冷却后取出切片，蒸馏水洗1次3分钟，TBS洗2次每次3分钟。
4. 每张切片加一滴或50ul 3％过氧化氢溶液，室温下孵育10min， 以阻断内源性过氧化物酶的活性。 TBS冲洗3次，每次3min。
5. 除去TBS液，加一滴或50ul 一抗（灭活PLB免疫小鼠所得到的多抗，1:3000稀释），阴性对照采用普通血清， 室温下孵育2小时，或4℃过夜。
6. TBS洗3次，每次5min，除去TBS液，每张切片加一滴或50ul polymer enhancer（试剂A）， 室温下孵育20min， TBS冲洗3次， 每次3min。
7. 除去TBS液，每张切片加一滴或50ul 过氧化物酶标记的抗鼠/兔聚合物（试剂B），室温下孵育30min，TBS洗3次，每次3min。
8. 除去TBS液，每张切片加一滴或50ul 新鲜配制的DAB，显色3－10min。
9. 自来水冲洗，苏木素复染10min，水冲洗。0.1%的盐酸分化，自来水冲洗，TBS返蓝。
10. 不需脱水，直接用中性树脂封片。
注意事项
抗原修复时必须保证切片始终能浸泡在液体内，一定要等工作液冷却后才能将切片取出。
