单克隆抗体培养上清与腹水的制备——上清的大规模制备

2019.4.07

实验步骤	附加材料（其他材料见基本方案 1) 含有 5〜10 mmol/L HEPES 的 DMEM 完全培养基和 DMEM-IO 完全培养基（附录1) ， pH 为 7. 2〜7.4 7 0 % (VAO 乙醇FBS 1 0 % (m A O 叠氮钠，可选的 850 cm² 滚筒式培养瓶和滚筒装置， 37°C 250 ml 塑料锥底离心管，无菌 Beckman 离心机和 JS-5. 2 转子（或同等设备） 0.45 um 过滤装置，可选的 1.增殖杂交瘤（见基本方案 1 ，步骤 1)，以 1 : 1 0 的比例分离部分细胞到装有 DMEM-10/ 5〜10 mmol/L HEPES 培养基的 175 cm2 培养瓶中（使培养液总共 100 ml)。为了用蛋白 A-亲和色谱法纯化 MAb，需单独检测有 FBS 的培养基以排除污染（可能会与 MAb —起被纯化出的杂蛋白）。如果需要，则在无血清培养基中培养细胞。 2.当细胞已达到分离移种标准（一般为 IXlO6〜2 X 106 个细胞/ ml) 时，将培养瓶内容物转移到 850 cm2 滚筒式培养瓶中。加入 150 mlDMEM-10 完全/ HEPES 培养基(使培养液总量达到 250 ml)。塞紧瓶塞，置于滚筒装置，于恒温室或培养箱 37°C 恒温培养 1〜2d。 3.用浸有 7 0 % 乙醇的纱布擦拭培养瓶口和瓶颈。打开培养瓶，加入 250m l 含有HEPES 培养基的 DMEM-IO 完全培养液（使培养液总量达到 500 ml)。塞紧瓶塞，置于滚筒装置， 37°C 恒温培养 1〜2d。 4.擦拭瓶口，打幵培养瓶，加入 2L 含有 HEPES 的 DMEM-IO 完全培养液（使培养液总量达到 2500 ml) ，基本装满整个培养瓶。为防止起泡，先加入培养基，后加入FBS 至培养液总量的 1 0 % 。塞紧瓶塞，置于滚筒装置， 37°C 恒温培养至培养基变黄 (大约需要 5d; 不要过长时间滚动培养瓶，以免细胞发生破碎）。 5.将培养液倒入 250 ml 锥底离心管。室温下， 250 g 离心 20 min。取上清，弃沉淀。若不进行培养上清的生物学检测，则加入 1 0 % 的叠氮钠溶液至总量的 0 . 0 2 % 。若需对培养上清进行亲和色谱或盐析纯化，先用 0• 45um过滤装置过滤培养上清。将培养上清分装后冰冻储存。展开

实验步骤

附加材料（其他材料见基本方案 1)

含有 5〜10 mmol/L HEPES 的 DMEM 完全培养基和 DMEM-IO 完全培养基（附录1) ， pH 为 7. 2〜7.4

7 0 % (VAO 乙醇FBS

1 0 % (m A O 叠氮钠，可选的

850 cm² 滚筒式培养瓶和滚筒装置， 37°C

250 ml 塑料锥底离心管，无菌

Beckman 离心机和 JS-5. 2 转子（或同等设备）

0.45 um 过滤装置，可选的

1.增殖杂交瘤（见基本方案 1 ，步骤 1)，以 1 : 1 0 的比例分离部分细胞到装有 DMEM-10/ 5〜10 mmol/L HEPES 培养基的 175 cm2 培养瓶中（使培养液总共 100 ml)。为了用蛋白 A-亲和色谱法纯化 MAb，需单独检测有 FBS 的培养基以排除污染（可能会与 MAb —起被纯化出的杂蛋白）。如果需要，则在无血清培养基中培养细胞。

2.当细胞已达到分离移种标准（一般为 IXlO6〜2 X 106 个细胞/ ml) 时，将培养瓶内容物转移到 850 cm2 滚筒式培养瓶中。加入 150 mlDMEM-10 完全/ HEPES 培养基(使培养液总量达到 250 ml)。塞紧瓶塞，置于滚筒装置，于恒温室或培养箱 37°C 恒温培养 1〜2d。

3.用浸有 7 0 % 乙醇的纱布擦拭培养瓶口和瓶颈。打开培养瓶，加入 250m l 含有HEPES 培养基的 DMEM-IO 完全培养液（使培养液总量达到 500 ml)。塞紧瓶塞，置于滚筒装置， 37°C 恒温培养 1〜2d。

4.擦拭瓶口，打幵培养瓶，加入 2L 含有 HEPES 的 DMEM-IO 完全培养液（使培养液总量达到 2500 ml) ，基本装满整个培养瓶。为防止起泡，先加入培养基，后加入FBS 至培养液总量的 1 0 % 。塞紧瓶塞，置于滚筒装置， 37°C 恒温培养至培养基变黄
(大约需要 5d; 不要过长时间滚动培养瓶，以免细胞发生破碎）。

5.将培养液倒入 250 ml 锥底离心管。室温下， 250 g 离心 20 min。取上清，弃沉淀。若不进行培养上清的生物学检测，则加入 1 0 % 的叠氮钠溶液至总量的 0 . 0 2 % 。若需对培养上清进行亲和色谱或盐析纯化，先用 0• 45um过滤装置过滤培养上清。将培养上清分装后冰冻储存。

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